犬正常发情期与患子宫蓄脓的子宫和卵巢组织结构及乳铁蛋白表达的对比

刘雨珂，徐倩倩，孙佩芳，陈美伊，刘铭峰，段德勇

(湖南农业大学动物医学院，长沙 410128)

子宫和卵巢作为雌性生殖系统中重要的器官，其结构会随生理阶段的改变及激素的作用而发生变化。由于在发情期犬卵巢大量分泌雌激素和孕激素，使得子宫发生如子宫内膜和肌层增厚、子宫腺管平均直径增加等变化[1-3]，这些变化易诱发犬子宫内膜发生囊性增生(CEH)，加之子宫颈的开张，易使细菌侵入子宫，引起子宫内膜感染，导致犬子宫蓄脓的发生[4]。虽已有诸多学者针对犬发情周期卵巢与子宫组织学结构[5]，诱导发情后犬生殖器官组织学及组织化学特征[6]，子宫蓄脓犬子宫和卵巢显微及超微结构[7]，比格犬间情期与发情期卵巢与子宫组织形态学观察[8]，犬子宫蓄脓的组织病理学观察和微生物分析[9]，犬子宫雌激素受体的免疫组化检测及其与性激素水平的关系[10]等进行了研究，但上述研究均没有对比观察正常发情期与患子宫蓄脓时犬子宫和卵巢的组织结构变化。

乳铁蛋白(lactoferrin，LF)作为非特异性免疫的重要组成部分，不仅存在于乳腺的分泌物中，还广泛存在于生物体其他的体液和分泌物中，已证实其可在局部与Fe3+相结合而抑制细菌生长、参与局部免疫[11]。国内对LF的功能研究表明，一定剂量的LF可在小鼠肠道内有明显的抑菌作用[12]；通过慢性鼻窦炎钩突黏膜中LF表达的研究，证实LF还存在于生物体其他分泌物中，并可参与构建局部免疫防御系统[13]。Esteban等[14]发现LF具有调节巨噬细胞活性和刺激淋巴细胞合成的能力；Kolm等[15]发现LF在马子宫内膜的表达量会随发情周期的变化而改变。但是目前尚未有研究表明LF在正常发情期和患子宫蓄脓时犬的子宫和卵巢中有表达，并参与局部免疫。鉴于此，本研究对发情期、乏情期犬的子宫与卵巢、患子宫蓄脓犬的子宫与卵巢，运用组织化学及免疫组织化学方法，对比分析组织结构的变化及乳铁蛋白的表达情况，拟为犬生殖生理的研究及子宫蓄脓疾病的预防及治疗提供形态学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 所有样品均由湖南农业大学动物医院经绝育手术采集，其中选取2～3岁健康犬发情期5例、乏情期5例，6～10岁患子宫蓄脓疾病犬5例。

1.1.2 主要试剂 兔多克隆乳铁蛋白(Lactoferrin，LF)抗体(11096-RP02)购自北京义翘神州生物技术有限公司；免疫组化SP染色试剂盒(SP-9001)购自北京中杉金桥生物技术有限公司；DAB显色试剂购自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 组织化学染色法 组织经4%多聚甲醛固定后，梯度酒精逐级脱水，二甲苯透明，常规石蜡包埋，切片厚5 μm。切片经脱水、脱蜡后分别进行Masson’s、VVG、PAS染色，脱水、透明、封片。显微镜下观察并拍照。Masson’s三色(苯胺蓝)染色，胶原纤维呈蓝色，细胞质和肌纤维呈红色，核呈灰黑色；VVG染色弹力纤维呈黑色或蓝黑色，细胞质和肌纤维呈黄色，胶原纤维呈红色，核呈灰黑色；PAS染色显示糖原及其他PAS反应阳性物质均呈阳性，细胞核呈蓝色。

1.2.2 免疫组织化学SP法检测LF的分布 1)5 μm石蜡切片常规脱蜡至水；2)在pH6.0且0.01 mol·L-1柠檬酸缓冲液中进行微波抗原修复，高火煮沸5 min后，中火维持8 min，室温下自然冷却；3)pH7.4 且0. 01 mol·L-1的PBS内洗涤3次，每次3 min；4)滴加3%过氧化氢溶液，37 ℃下孵育10 min； 5)同步骤3；6)滴加封闭液(SP试剂盒中A液，即10%非免疫性动物血清)，湿盒中37 ℃下孵育15 min；7)滴加一抗(1∶1 000比例稀释的兔多克隆LF抗体)，湿盒中37 ℃孵育2 h，同时添加1组 阴性对照(用0.01 mol·L-1PBS 代替一抗)；8)同步骤3；9)滴加生物素标记的二抗(SP试剂盒中B液)，37 ℃下孵育15 min；10)同步骤3；11)滴加SP试剂盒中C液(即过氧化物酶标记的链霉亲和素)，湿盒中37 ℃下孵育15 min；12)同步骤3；13)滴加新鲜配制的DAB 显色3～10 min；14)自来水冲洗，苏木精复染、脱水、透明、封片。显微镜下观察并拍照。

1.2.4 发情周期的确认及子宫蓄脓病的诊断 乏情期与发情期的划分以马文芝[16]对犬发情周期内临床生理行为特征的研究为依据，结合犬主描述，初步判定犬的发情阶段。绝育术采集样本后，制作石蜡切片，并通过与Andersen等[17]和Vermeirsch等[18]对犬卵巢和子宫组织形态学的研究结果进行比对，最终确定本文采集到的犬子宫和卵巢样本处于乏情期和发情期。患子宫蓄脓犬子宫和卵巢样本的采集是通过观察病犬精神沉郁、腹部肿大、阴道可见脓性分泌物等临床症状；血常规检查白细胞、中性粒细胞数增加；B超检查子宫腔中呈低回声暗区，初步确诊为子宫蓄脓。通过手术取出子宫后，发现子宫角膨大，呈暗红色(图1)，切开后见大量黏稠脓性内容物，符合子宫蓄脓病理特征。

图1 患子宫蓄脓犬的子宫和卵巢Fig.1 Uterus and ovary of dog with pyometra

2 结 果

2.1 正常发情期犬子宫和卵巢组织结构特点

2.1.1 子宫肌层结构特点 乏情期肌束排列紧密，肌束间胶原纤维较少，肌纤维胞核较大，呈椭圆形且位于周边，胞质红染(图2 A、B)；发情期肌束间隙增大，内纵行肌层肌束间隙显著增大，且胶原纤维较多，肌纤维胞核较小，呈圆形位于中央，胞质淡粉色(图2 D、E)。在肌层间的血管层中，乏情期与发情期子宫血管内弹性膜清楚，呈明显的波浪状，外膜中含有丰富的弹性纤维(图2 C、F)。内膜肌层厚度比(内膜厚度/肌层厚度)在不同时期显著不同：乏情期和发情期分别为0.762 0、0.924 3。

A、B. 乏情期子宫肌层；C. 乏情期子宫血管层血管；D、E. 发情期子宫肌层；F. 发情期子宫血管层血管；S. 浆膜层；CML. 环肌层；L. 血管腔；E. 外膜；M. 中膜；A、D. HE染色；B、E. Masson染色；C、F. VVG染色A， B. Myometrium in anestrus; C. Blood vessels of vascular layer of uterus in anestrus; D, E. Myometrium of uterus during estrus; F. Blood vessels of uterine vascular layer during estrus; S. Serosa; CML. Circular muscle layer; L. Lumen; E. Tunica externa; M. Tunica media; A, D. HE staining; B, E. Masson staining; C, F. VVG staining图2 发情期和乏情期犬子宫肌层结构Fig.2 Structure of dog myometrium in estrus and anestrus

2.1.2 子宫内膜结构特点 乏情期固有层子宫腺在200×镜头下每个视野中的平均数为5～7个；深层腺管数多，且管径小于浅层腺管；腺上皮细胞为单层高柱状上皮，胞核呈圆形位于细胞的基底；胶原纤维含量较多，血管四周有少量弹性纤维(图3 A～C)。发情期固有层子宫腺每个视野平均数为18～23个；腺管管径大于乏情期；腺上皮细胞为立方上皮，胞核呈卵圆形或圆形，位于细胞中央；胶原纤维含量少于乏情期，血管周围无弹性纤维(图3 E～G)。

PAS染色显示，子宫腺上皮细胞靠近腺腔处，乏情期、发情期均有阳性反应，且乏情期阳性反应程度大于发情期(图3 D、H)。

A～D. 乏情期子宫固有层；E～H. 发情期子宫固有层；LP. 固有层；UG. 子宫腺；A、E. HE染色；B、F. Masson染色；C、G. VVG染色；D、H. PAS染色A-D. Lamina propria of uterus in anestrus; E-H. Lamina propria of uterus during estrus; LP. Lamina propria; UG. Uterine gland; A, E. HE staining; B, F. Masson staining; C, G. VVG staining; D, H. PAS staining图3 发情期和乏情期犬子宫固有层结构Fig.3 Structure of dog lamina propria in estrus and anestrus

乏情期子宫黏膜上皮为单层柱状上皮，胞核呈柱状或圆形位于细胞的中央，胞质染色深，有散在的淋巴细胞；PAS反应集中于黏膜上皮细胞胞质及管腔中阳性分泌颗粒(图4A、C)。发情期黏膜上隐窝较乏情期数量多，子宫黏膜上皮细胞内有聚集脂滴，形成泡沫状上皮细胞，胞核位于细胞顶部且染色深，胞质淡染；PAS反应集中于黏膜上皮细胞基底面和游离面(图4B、D)。

A、C. 乏情期子宫黏膜；B、D. 发情期子宫黏膜；EM. 子宫内膜；A、B. HE染色；C、D. PAS染色A, C. Endometrium of anestrus; B, D. Endometrium of estrus; EM. Endometrium; A, B. HE staining; C, D. PAS staining图4 发情期和乏情期犬子宫黏膜结构Fig.4 Structure of dog uterine mucosa in estrus and anestrus

2.1.3 卵巢结构特点 乏情期卵巢皮质中原始卵泡数量较多，初级卵泡和次级卵泡较少，有腔卵泡数量少。发情期卵巢皮质中可见1～2个大黄体，并有成熟卵泡及少量的初级卵泡和次级卵泡(图5A、D)。卵巢中胶原纤维数量在不同时期显著不同，发情期较乏情期多。在PAS反应中，均可在卵泡透明带处发现阳性反应，且强度相同(图5B、E)。在髓质中，乏情期与发情期卵巢血管内弹性膜清晰，外膜中含有较多弹性纤维(图5C、F)。

2.2 患子宫蓄脓犬子宫和卵巢结构特点

2.2.1 子宫肌层结构特点 患子宫蓄脓时犬子宫外环形肌层肌束排列较为紧密，肌层间填充有较多胶原纤维，单个肌纤维体积增大，胞核呈针锥形位于中央，胞核周围出现空白区域，呈现肿胀状态，胞质淡染(图6A、B)。子宫血管内弹性膜变薄且有断裂，外膜中弹性纤维含量减少(图6C)。内膜肌层厚度比为1.615 0。

2.2.2 子宫内膜结构特点 患子宫蓄脓时犬子宫固有层子宫腺在200×镜头下每个视野中的平均数为2～3个；腺管管径较乏情期和发情期大，且形状不规则，腺腔内有少量巨噬细胞和大量中性粒细胞浸润；腺上皮细胞发生空泡变性与胞质增生，细胞边界不清，在基膜处有散在的淋巴细胞(图7A)。胶原纤维含量较乏情期和发情期少，血管周围无弹性纤维(图7B、C)。在PAS阳性反应中，子宫腺上皮细胞的阳性反应程度较乏情期弱，比发情期强(图7D)。

患子宫蓄脓时犬子宫黏膜为单层柱状上皮，胞核呈圆形位于细胞基底，细胞发生空泡样变性；PAS反应集中于黏膜上皮细胞游离面及胞质内(图7E、F)。

A, B. 患子宫蓄脓时犬子宫肌层；C. 患子宫蓄脓时犬子宫血管层血管；S. 浆膜层；CML; 环肌层；A. HE染色；B. Masson染色；C. VVG染色A, B. Myometrium of dog uterus with pyometra; C. Blood vessels of vascular layer of dog uterus with pyometra; S. Serosa; CML. Circular muscle layer; A. HE staining; B. Masson staining; C. VVG staining图6 患子宫蓄脓时犬子宫肌层结构Fig.6 Myometrial structure of dog uterus with pyometra

2.2.3 卵巢结构特点 患子宫蓄脓时犬卵巢中出现由液体分泌物聚集而成的卵巢囊泡，皮质中可见1～2个大黄体，大量闭锁卵泡，正常卵泡较少(图8A)。卵巢中胶原纤维含量较正常发情期少。在卵泡透明带处见PAS阳性反应，强度与正常发情期相同(图8B)。卵巢血管内弹性膜不连续，外膜中含有少量弹性纤维(图8C)。

2.3 LF在正常发情期犬子宫和卵巢中的表达

2.3.1 LF在子宫中的表达 LF主要在子宫腺上皮细胞、子宫黏膜上皮细胞中有表达(图9A～D)。在子宫腺上皮细胞中，乏情期LF的阳性表达水平高于发情期 (P<0.05)；在子宫黏膜上皮细胞中，发情期LF的阳性表达水平高于乏情期(P<0.05)(表1)。

2.3.2 LF在卵巢中的表达 LF在黄体、卵泡、间质、血管、生殖上皮中均有表达(图10A～J)，且乏情期LF的阳性表达水平显著高于发情期(表2)。LF在生殖上皮中的表达部位在正常发情期略有不同，表现为乏情期主要集中于生殖上皮细胞核，发情期主要在生殖上皮胞质内有表达(图10 E、J)。

2.4 LF在患子宫蓄脓犬子宫和卵巢中的表达

2.4.1 LF在子宫中的表达 LF在中性粒细胞、管腔、子宫腺上皮细胞和黏膜上皮细胞中均有表达(图11A、B)。在子宫腺上皮中，患子宫蓄脓时LF的阳性表达高于发情期 (P<0.05)。在子宫黏膜上皮细胞中，患子宫蓄脓时和乏情期表达水平相近(表1)。

A～D. 患子宫蓄脓时犬子宫固有层；E、F. 患子宫蓄脓时犬子宫黏膜；LP. 固有层；UG. 子宫腺；EM. 子宫内膜；A、E. HE染色；B. Masson染色；C. VVG染色；D、F. PAS 染色A-D. Lamina propria of dog uterus with pyometra; E, F. Endometrium of dog with pyometra; LP. Lamina propria; UG. Uterine gland; EM. Endometrium; A, E. HE staining; B. Masson staining; C. VVG staining; D, F. PAS staining图7 患子宫蓄脓时犬子宫固有层和黏膜结构Fig.7 Structure of the lamina propria and mucous membrane of dog uterus with pyometra

A. 患子宫蓄脓时犬卵巢皮质；B. 患子宫蓄脓时犬卵巢卵泡；C. 患子宫蓄脓时犬卵巢血管；PrF. 原始卵泡；PO. 初级卵泡；CL. 黄体；L. 血管；A. HE染色；B. Masson染色；C. VVG染色A. Ovarian cortex of dog uterus with pyometra; B. Ovarian follicle of dog uterus with pyometra; C. Ovarian blood vessel of dog uterus with pyometra; PrF. Primordial follicle; PO. Primary follicle; CL. Corpus luteum; L. Blood vesse; A. HE staining; B. Masson staining; C. VVG staining图8 患子宫蓄脓时犬卵巢结构Fig.8 Ovarian structure of dog with pyometra

A. 乏情期子宫固有层；B. 乏情期子宫内膜；C. 发情期子宫固有层；D. 发情期子宫内膜；A～D阴性对照分别对应右上角插图；LP. 固有层；UG. 子宫腺；EM. 黏膜上皮；L. 子宫管腔；MF. 黏膜皱襞A. Lamina propria of uterus in anestrus; B. Endometrium of anestrus; C. Lamina propria of uterus during estrus; D. Estrus endometrium; The negative control is corresponding to the illustration in the upper right corner in A-D; LP. Lamina propria; UG. Uterine gland; EM. Endometrium; L. Uterine lumen; MF. Mucosal fold图9 发情期和乏情期犬子宫中LF的表达Fig.9 Expression of LF in the uterus of dog during estrus and anestrus

A～J.LF免疫组化染色，a～j.相应的阴性对照；A～E,a～e.乏情期卵巢；F～J,f～j.发情期卵巢；A、F.卵巢卵泡；B、G.黄体；C、H.髓质；D、I.血管；E、J.生殖上皮A-J.LF Immunohistochemical staining, a-j.Corresponding negative control; A-E, a-e.Anestrous ovary; F-J, f-j.Estrous ovary; A, F.Ovarian follicle; B, G.Corpus luteum; C, H.Medulla; D, I.Blood vessel; E, J.Germinal epithelium 图10 发情期和乏情期犬卵巢中LF的表达Fig.10 Expression of LF in the ovary of dog during estrus and anestrus

A. 患子宫蓄脓时犬子宫固有层; B. 患子宫蓄脓时犬子宫内膜; 阴性对照分别对应右上角插图；LP. 固有层; UG. 子宫腺; EM. 黏膜上皮; L. 子宫管腔; MF. 黏膜皱襞A. Lamina propria of dog uterus with pyometra; B. Endometrium of dog with pyometra; The negative control is corresponding to the illustration in the upper right corner; LP. Lamina propria; UG. Uterine gland; EM. Endometrium; L. Uterine lumen; MF. Mucosal fold图11 患子宫蓄脓时犬子宫中LF的表达Fig.11 Expression of LF in dog uterus with pyometra

2.4.2 LF在卵巢中的表达 LF在黄体、卵泡、间质、血管、生殖上皮中均有表达(图12 A～F)，且患子宫蓄脓时的阳性表达量显著低于乏情期，但高于发情期(表2)。生殖上皮中LF的表达部位主要集中于生殖上皮胞质基底部。

表1 正常发情期及患子宫蓄脓时犬子宫组织中LF的平均光密度值

表2 正常发情期及患子宫蓄脓时犬卵巢组织中LF的平均光密度值

3 讨 论

雌激素和孕酮是重要的生殖激素。在发情前期、发情期卵泡发育过程中，卵泡颗粒细胞会分泌并释放雌激素，子宫及生殖道在雌激素的作用下发生充血、黏膜层增厚、黏膜上皮增生、管状腺体长度增加、分泌增强等生理反应。当成熟卵泡破裂排卵后，卵泡颗粒细胞分化成粒性黄体细胞，形成黄体并分泌孕酮。正常情况下，孕酮可以促进子宫内膜层增生增厚，减弱子宫平滑肌层的运动，抑制子宫内局部免疫作用。本研究发现，患子宫蓄脓时犬卵巢出现持久黄体，这与Bostedt等[19]研究结果相同。而持久黄体使得卵巢不断分泌孕酮，从而使血清中孕酮浓度持续升高，高浓度孕酮将抑制抗原递呈细胞的成熟，降低白细胞抵抗细菌感染的能力[20]，加之雌激素使子宫颈开放、子宫内膜增生、子宫腺分泌增加，最终使子宫腺体囊性增生，为病原菌的侵入及繁殖创造了条件。

由于子宫腺分泌细胞能合成糖原、中性黏多糖、酸性黏多糖及脂类等物质[27]，利用PAS反应可观察到腺细胞的分泌活动。本研究通过此方法对犬正常发情期与患子宫蓄脓时糖原在子宫和卵巢中的分布进行了观察，发现在子宫黏膜上皮细胞中，发情期黏膜上皮细胞的游离面和基底面均有PAS阳性反应，这与Gregoraszczuk等[28]研究结果相似。在子宫固有层中，乏情期腺上皮细胞游离面可见PAS强阳性反应，发情期中只有少量PAS阳性反应，这与Stroband等[29]对雌性周期和早期妊娠期间猪子宫上皮的PAS观察结果相似。当犬患有子宫蓄脓时，糖原不规律的分布在细胞游离缘，这可能是由于炎性产物对上皮细胞结构的破坏，导致糖原分泌下降及无规律的分布[30]。正常发情期和患子宫蓄脓时犬卵巢PAS反应在透明带处均呈阳性且强度相同，说明透明带在上述情况下分泌和合成糖原的程度相同。

LF是一种具有多种生理活性的天然蛋白质，不仅是乳腺组织分泌的非特异性保护蛋白质，还存在于如泪、汗、唾液、胆汁、胰液、小肠腺液等外分泌物中[10]。LF具有广谱的抗菌活性[31]，同时还具有调节巨噬细胞活性和刺激淋巴细胞合成的能力，对抗体生成、T细胞成熟、淋巴细胞中自然杀伤细胞比例均具有调节作用[14]。本研究发现，LF在子宫腺上皮细胞、子宫黏膜上皮细胞和患子宫蓄脓时的中性粒细胞，以及在卵巢黄体、卵泡、间质、血管、生殖上皮中均有表达，这与Kolm等[15]的观察结果相一致。同时，本研究还发现在子宫黏膜层中，发情期LF的阳性表达水平高于乏情期，这与Tsumagari等[32]将大肠杆菌接种到出现黄体生成素波前的母犬中，经12 d后并再次恢复的结果相吻合。在发情期LF阳性表达水平高，且此时发生子宫蓄脓的概率较小，可能是由于LF在黏膜分泌物中具有较强铁结合能力和使局部形成相对无铁状态，这有助于黏膜表面的天然免疫反应，从而限制了大多数病原体包括大肠杆菌的入侵和感染[33]。

4 结 论

本研究运用组织学、组织化学及免疫组化技术，对正常发情期与患子宫蓄脓时犬子宫与卵巢的组织结构及LF的表达情况进行了研究。发现子宫内膜肌层比在犬患子宫蓄脓时最大，发情期次之，乏情期最小；从乏情期到发情期，子宫腺管腔逐步扩大，腺细胞体积缩小；当犬患有子宫蓄脓时，子宫腺腺管管径进一步扩大，内有中性粒细胞浸润；LF在子宫腺上皮细胞、子宫黏膜上皮细胞和患子宫蓄脓时的中性粒细胞，以及在卵巢黄体、卵泡、间质、血管、生殖上皮中均有表达。