岩溶地区典型蕨类植物卷柏根系分泌有机酸特征1)

张雅洁 刘云根 王妍 杨波

(云南省山地农村生态环境演变与污染治理重点实验室(西南林业大学)，昆明，650224)

钙是植物必需的矿质营养元素，对植物的生长发育和生理活动起到关键性作用，在应对环境胁迫中处于中心调控地位[1]。研究表明，钙缺乏会导致植物在生长过程中出现某些生理活动紊乱和病害问题[2]，高钙则会对植物的光合作用和生长发育产生影响，抑制呼吸作用，或者阻碍信号的传导影响植物的正常发育，严重还会导致细胞器破裂致使植物死亡[3]。岩溶石漠化地区土壤钙含量高，是一般地区土壤钙的5～15倍[4]，大量植物因高钙影响根系发育、代谢途径、细胞结构造成无法正常成长甚至死亡[5-7]，仅有少数耐钙或喜钙植物能正常生长[8]，因此在喀斯特石漠化生态恢复过程中，物种选择至关重要。卷柏(Selaginellatamariscina)为多年生草本，是岩溶地区常见的先锋植物，对各种极端恶劣环境有较强的适应能力[9]，目前对卷柏的研究成果主要集中在其地上部分药用价值方面，已知叶片中分离得到包括黄酮、生物碱、多糖、有机酸等物质[10]。但鲜有关于卷柏生态适应性以及对环境修复方面的报道。而根系分泌物是植物长期适应外界环境而形成的一种适应机制。在根系分泌物中，有机酸影响根际环境，在众多的根系分泌物质中作用最为重要，研究表明，根系分泌有机酸改变了土壤的理化性质，以促进植物对所需养分的吸收[11]，并对植物的多种生理生态过程起到重要影响，调节植物对环境的适应性，增强对不良环境的抗性，而根系对于土壤中的胁迫作用往往能做出反应，因此探析植物根系分泌物对岩溶地区的高钙环境的适应性，对岩溶地区生态系统恢复和重建具有重要意义。本研究采用砂培方式测定不同钙浓度条件下卷柏根系分泌有机酸种类和组成特征，探析岩溶地区典型先锋植物卷柏对高钙环境的适应机制，以期为石漠化地区植被恢复提供理论参考和技术指导。

1 材料与方法

卷柏(S.tamariscina)，为蕨类卷柏科(Selaginellaceae)卷柏属(Selaginella)卷柏的全草，多年生草本，又名长生不死草、九死还魂草、石莲花等，是一类出现于中石炭世的原始而古老的蕨类植物[12]。卷柏分布广泛，多生于向阳的山坡岩石上，或干旱的岩石缝中，该种既可观赏，又有很高的药用价值。本研究供试卷柏采集自云南省昆明市西山向阳坡岩溶山地，所采植株保证生长状况、植株大小基本一致。

1.1 试验设计与处理

试验采用室内模拟的方式进行，控制室温在(25±1)℃。采用控制霍格兰营养液中硝酸钙(Ca(NO3)2)的方式配制成7种钙梯度的营养液，硝酸钙浓度分别为0、5、30、70、100、200、300 mmol·L-1，每种梯度设置5个重复，共35个处理。其中0 mmol·L-1的Ca2+模拟缺钙环境，5 mmol·L-1用以模拟酸性土中交换态钙平均浓度，100 mmol·L-1用以模拟石灰土中交换态钙平均浓度，并将营养液pH值控制在6.0～6.5，一次性配制试验期间所用营养液。培养基质石英砂在植物移栽前先用水浸泡，后加入5%盐酸浸泡24 h后用过量水冲洗至中性后装盆晾干，以排除其它因素对实验结果的影响。待植物生长正常后移栽植株，移栽过程中保证根系完整，清洗植株并作消毒处理，至石英砂环境下培养，每个钙梯度设置5个平行处理，每盆1株植物。每天每盆施入100 mL营养液，保证各处理的施入量和施入时间一致。移栽30 d后统一收集卷柏根系分泌物，具体步骤如下：(1)将植物从石英砂中取出，用200 mL去离子水冲洗根部，通过双层定性滤纸过滤，即得到根系分泌物的粗提物；(2)将粗提物加入V(分液漏斗)∶V(二氯甲烷)=1∶1萃取2次，合并萃取液；(3)萃取液放至旋转蒸发仪浓缩蒸发，减压浓缩至干后用2 mL分析甲醇润洗溶解有机相并过0.45 μm有机滤膜后装入2 mL棕色液相瓶冷藏保存备用。

1.2 测定方法

提取后的根系分泌物采用GC-MS(Agilent 7890A-5975C)测定。采用电子轰击源，轰击电压70 eV，扫描范围m/z30～600 amu，扫描速度0.2 s扫全程，离子源温度230 ℃。毛细管柱：HP-5MS柱(30.00 m×0.25 mm×0.25 μm)，进样口温度250 ℃，柱温50 ℃(2 min)，以6 ℃/min程序升温至250 ℃(保持15 min)。载气为He，流量1 mL/min。应用NIST08质谱数据库，分析质谱图，确定各组分物质名称，并采用峰面积归一化法计算各物质的质量分数。

1.3 数据处理与分析

采用SPSS17.0、Microsoft Excel 2010等软件对实验数据进行统计分析和制图。

2 结果与分析

2.1 岩溶地区钙对根系分泌有机酸种类的影响

在缺钙条件下，卷柏根系分泌有机酸的种类最多，共有12种酸类物质(表1)。当在有少量Ca2+出现的酸性土环境时，根系分泌有机酸的种类为9种。之后随着钙浓度增加卷柏根系分泌物中的有机酸种类逐渐减少，Ca2+浓度为30和70 mmol·L-1时，根系分泌有机酸种类相同为6种。当Ca2+浓度增加到100 mmol·L-1的石灰土环境时，共检测出5种有机酸。之后当Ca2+浓度增加到200和300 mmol·L-1的高钙环境时检测出的有机酸种类分别为4种和3种。

在缺钙环境下卷柏根系会产生更多种类的根系分泌有机酸，相比酸性土环境增加了3种。钙浓度达到酸性土钙含量后随着钙离子浓度的增加卷柏根系分泌有机酸的种类开始减少，5到30 mmol·L-1之间钙浓度相差较小，但有机酸种类存在显著差异，而30与70 mmol·L-1以及200与300 mmol·L-1之间虽钙浓度跨度较大，但有机酸种类间没有显著差异。用以模拟缺钙、酸性土、石灰土的0、5、100 mmol·L-13种梯度间有机酸种类均存在显著差异。

表1 不同钙胁迫对卷柏根系分泌有机酸种类的影响

2.2 岩溶地区不同钙浓度条件下根系分泌有机酸特有成分

使用峰面积归一化法计算不同钙浓度条件下卷柏根系分泌的特有酸的质量分数，从表2可以看出检测出的特有酸都是低质量分数有机酸。当在酸性土环境时，存在6种特有酸，花生酸(0.36%)、木蜡酸(0.21%)、山萮酸(0.17%)、正十七烷酸(0.10%)、亚油酸(0.55%)、棕榈油酸(0.69%)。缺钙条件下的特有酸种类最多，共鉴定9种，相比酸性土环境增加了肉豆蔻酸(0.13%)、正十五烷酸(0.09%)、3-(3,5-二叔丁基-4-羟基苯基)丙酸(0.06%)3种特有有机酸，这3种酸仅在缺钙条件下分泌，是卷柏根系在缺钙环境中分泌的特有性有机酸，此外，除正十七烷酸的质量分数与在酸性土条件下相同外，其它几种特有酸的质量分数都有不同程度的增加。

当Ca2+浓度从酸性土环境增加到30 mmol·L-1时，木蜡酸、正十七烷酸、山萮酸消失，其它特有酸的质量分数也相对降低。随着钙浓度升高，各类特有有机酸开始逐渐从组分中消失。当Ca2+浓度到达石灰土环境时，仅存在花生酸(0.11%)、亚油酸(0.15%)，当钙浓度达到300 mmol·L-1时，特有酸全部消失。

表2 不同钙胁迫对卷柏根系分泌有机酸特有酸类质量分数的影响

2.3 岩溶地区钙不同钙浓度条件下卷柏根系分泌有机酸共有成分与分布特征

在7种不同钙浓度环境下都出现的共有酸有3种，油酸、棕榈酸及硬脂酸。油酸在酸性土环境下质量分数为11.5%，在缺钙环境下质量分数陡然上升到31.21%。酸性土与石灰土环境下油酸的质量分数也存在显著差异，但相比缺钙环境质量分数的变化较为稳定。棕榈酸及硬脂酸在酸性土环境下的质量分数分别为7.12%和2.15%，在缺钙时质量分数也出现了显著性的增加，增加幅度小于油酸在相同环境间的变化幅度。在Ca2+浓度从酸性土环境逐渐向石灰土环境增加的过程中，油酸质量分数在Ca2+浓度30至70 mmol·L-1之间变化较小，直到达到石灰土环境时才出现显著差异；棕榈酸质量分数的变化则是当浓度达到70 mmol·L-1时就开始减缓；而硬脂酸相比其它两种酸，在整个过程中都保持一个相对较缓、变化较小的规律。当Ca2+浓度达到酸性土环境后，相比之前Ca2+浓度梯度间的跨度增大，但3种酸的质量分数的变化幅度一致变缓。油酸及硬脂酸在3个浓度间的质量分数没有显著差异，棕榈酸质量分数在Ca2+浓度200 mmol·L-1后也开始没有显著性差异。

在缺钙条件下，由于环境中缺钙，根系分泌油酸、棕榈酸及硬脂酸都显著高于酸性土环境。Ca2+浓度在酸性土到石灰土环境区间内，随着钙浓度的升高对植物根系分泌有机酸产生了抑制作用，3种酸的质量分数开始持续降低，在每个梯度之间都存在一定的显著差异。直到Ca2+浓度达到石灰土环境后，3种酸的质量分数变化开始趋于稳定，Ca2+的增加幅度加大，但3种酸类的质量分数没有显著差异，基本稳定在一个相近的数值内。

在7种Ca2+浓度梯度下，油酸的质量分数始终比其它两种酸更大，尤其在缺钙环境下植物分泌大量的油酸。酸性土环境时硬脂酸质量分数较棕榈酸和油酸的质量分数较小，油酸质量分数显著大于棕榈酸质量分数。在Ca2+浓度达到石灰土环境的过程中，3种酸都有不同程度的降低，3种酸的质量分数开始慢慢接近，Ca2+浓度达到石灰土环境时，硬脂酸质量分数依然相比其它两种酸较小，但油酸与棕榈酸之间的质量分数非常接近。之后随着钙浓度继续大幅增加，3种酸质量分数的差值继续减小，当钙离子浓度到达300 mmol·L-1时3种酸的质量分数之间的差值达到最小。可以看出，在高钙环境时，棕榈酸、油酸和硬脂酸的质量分数不再随着钙浓度的增加出现较大变化，且都稳定保持在一个较低但相对接近的浓度(表3)。

表3 不同钙胁迫对卷柏根系分泌有机酸共有酸质量分数的影响

3 结论与讨论

目前，关于根系分泌有机酸的相关研究主要集中在农作物、经济林木、草本植物和湿地植物，关于蕨类植物根系分泌有机酸的研究较少。而不同植物根系分泌有机酸的种类和分泌量也不同，通过此次研究得到了蕨类植物卷柏根系中稳定分泌的有机酸为棕榈酸、油酸、硬脂酸，随着环境中的钙浓度变化这3种有机酸始终稳定存在，且有相对较高的含量。根系是植物对土壤环境反应最敏感的部位，在植物受到环境影响时植物根系往往最先做出反应，而根系分泌物是植物根系对土壤环境生化适应的产物，植物在生长过程中，根系从环境中摄取养分的同时，也向环境中释放大量有机物，任何影响植物生长和生理的因素均会影响根分泌物的数量和种类[13-14]。已有研究表明，在养分缺乏的情况下，植物根系通过增加根系分泌有机酸的含量来应对，如缺磷环境下的构树、桑树、诸葛菜和油菜根系分泌有机酸的总量都增加[15]；缺铁导致鹰嘴豆根系分泌有机酸增加5～10倍[16]；缺锌促进了苹果有机酸向地下部的分配，根和茎中草酸和苹果酸的浓度提高了1.09～1.35倍，有机酸向根系的分配比例增加[17]。本研究的结果也验证了这一观点：钙作为植物生长中不可或缺的营养元素，在钙元素缺乏的情况下，卷柏通过增加根系分泌有机酸含量和种类，增加了肉豆蔻酸、正十五烷酸、3-(3,5-二叔丁基-4-羟基苯基)丙酸这3种缺钙胁迫下产生的特有酸，以及提高棕榈酸、油酸、硬脂酸3种共有有机酸的含量，即产生诱增有机酸来减轻逆境环境对植物的影响，促进植物对养分的吸收和利用，增加植物适应性以及保护植物的细胞膜系统[18]。所以在钙浓度为0 mmol·L-1条件下，由于根际环境缺钙卷柏根系开始分泌多种特有的低浓度有机酸，以及其它共有酸的质量分数也明显提高，这可能是卷柏应对营养元素缺乏时根系做出的适应机制，通过提高根系分泌有机酸的种类以及含量来提高植物抗性，保护养分缺乏对植物细胞膜系统的破坏。其中油酸质量分数的增加尤为显著，而油酸作为一种单不饱和脂肪酸，对植物响应多种非生物环境影响具有多重调节功能[19]，缺钙时卷柏分泌的大量油酸可能也对植物起到了重要的调节作用。

目前就高钙条件对植物根系分泌物的影响的研究尚未见报道，在本研究中，以5 mmol·L-1钙浓度模拟酸性土，100 mmol·L-1钙浓度模拟石灰土，从酸性土到石灰土，随着钙浓度的增加，植物根系分泌有机酸的种类逐渐减少，各酸类的质量分数也有显著降低。这是因为钙离子对植物的生长和生理产生了影响，抑制了根系对有机酸的分泌，从而导致根系分泌有机酸的种类和含量产生了变化。而当钙浓度达到石灰土的高钙环境后，钙离子的增加幅度变大，但根系分泌共有有机酸棕榈酸、油酸、硬脂酸的质量分数开始趋于稳定，不再随钙离子浓度的变化而产生较大变化，且3种酸的质量分数也保持在相似的数值。相关研究表明，天然脂肪酸类物质在防治植物病害、调节植物生理生态和生长发育以及改善土壤的理化性质方面有着很高的价值[20]。棕榈酸和油酸明显影响了植物的生理代谢，促进了植物的生长发育，两种脂肪酸提高了土壤中的酶活性，促进土壤中有机养分的转化，并且明显降低土壤中真菌的数量[21]。这可能是卷柏能在高钙的岩溶地区生存的原因，在面对极端逆境的高钙情况下，卷柏根系分泌的棕榈酸和油酸两种脂肪酸能保持在一个较稳定的状态，调节卷柏在逆境中的生理活动，但脂肪酸促进卷柏抵抗高钙环境的具体作用机理还有待进一步的研究。

综上所述，从植物抗逆性的角度考虑，卷柏能够在高钙环境的石灰土上正常生存的原因在于：当根际土壤处于高钙条件时，卷柏能够保持棕榈酸、硬脂酸、油酸3种共有酸相对稳定的分泌量，较稳定的有机酸含量为卷柏维护了根际环境的相对稳定。

实验设计Ca2+营养液7个浓度梯度上，卷柏根系分泌有机酸中的稳定成分有棕榈酸、油酸和硬脂酸，3种酸在所有浓度梯度上都具有相对稳定的含量，且在高浓度梯度环境下不具有显著性变化；在缺钙条件下，植物根系分泌有机酸种类增加，出现了多种仅在此浓度梯度下存在的特有酸，且3种共有酸成分的质量分数都明显增加；高钙环境下，根系分泌有机酸的种类相比低钙条件下降低，低钙胁迫下的特有酸逐渐消失，但3种共有有机酸保持在一定稳定水平，且钙浓度越高3种稳定根系分泌有机酸的质量分数越趋于一个稳定值。