东北地区主栽杨树品种的SSR分析及鉴定1)

王妍 李立华 徐宗艺 王艳敏 李静 白卉

(中国林学会，北京，100091) (黑龙江省林学会) (黑龙江省林业科学研究所(黑龙江省速生林木培育重点实验室))

杨树(Populusspp.)在分类学中的定位为杨柳科(Salicaceae)杨属(PopulusL.)，广泛的分布于华中、华北、东北、西北等辽阔的地区，我国杨树品种种类丰富，其中包含很多变种、杂交种、从境外引种的品系[1-3]。杨树木材，既在农业和林业产业中创造了可观的经济收益[4]，也在工业领域有着广泛的用途。为满足人类生产生活日益增长的需求，杨树新品种、良种、杂交品系不断推向市场，与此同时，识种辨种的困难也随之而来。传统的形态学特征描述，非专业人员无法精准而迅速的区分，导致苗木交易市场鱼目混珠，品种保护难以推行[5-6]，品种权人的权益难以保障。因此，研建切实有效的品种鉴别方法，并对各类品种进行有效区分十分必要[7-10]。SSR(simple sequence repeat，SSR)分子标记，具有多态性高、操作简便、共显性、多等位基因变异等优点，在探究遗传资源的多样性[11-12]、聚类分析、系统发育[13]等问题时具有明显优势[14]，因此，SSR分子标记技术现已在品种鉴别[15]、良种保护等许多方面得到广泛的应用。

本研究以东北地区杨树新品种、良种、广泛栽培的已知品种为研究对象，对各无性系进行SSR分析，从分子水平对40个无性系进行指纹图谱构建与遗传关系分析；利用各无性系的指纹图谱，制成包含DNA遗传背景、引物信息、产物片段长度等信息丰富且易于获取的二维码。本研究补充了全国杨属分子基因库，构建了杨属品种二维码，建立了便捷的杨属品种鉴别方法，研究结果可为东北地区杨树品种保护、品种鉴定等提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 试验杨属品种

本研究选择东北地区的40个杨属品种为试验材料，各品种由牡丹江阳明区育苗圃(代号为a)、黑龙江省林业科学研究所(代号为b)、白城市林业科学研究院(代号为c)、肇州县丰乐苗圃(代号为d)等单位提供(见表1)。

表1 40个杨属品种详细信息

1.2 试验方法

DNA提取及琼脂糖凝胶电泳检测：采集不同品种杨树新鲜叶片3～4片，完整放置于塑封袋内，保存于实验室冰箱中(-20 ℃)。利用百泰克生物技术有限公司生产的新型快速植物基因组DNA提取试剂盒，提取杨树基因组DNA，并取2 μL样品，在质量浓度为10 g/L的琼脂糖凝胶电泳中进行完整性检测。

合成引物：查阅相关文献及杨树引物库，委托苏州金唯智生物科技有限公司(https://www.genewiz.com.cn/)合成21对SSR引物(见表2)。

SSR反应体系的构建：SSR-PCR所需的反应液购买于北京百泰克生物技术有限公司，20 μL反应体系，其中包含PCR预混液10 μL、前后端浓度10 μmol/L的引物各1 μL、模板DNA1 μL、超纯水7 μL。PCR反应在美国ABI公司的VERITI型PCR仪上进行。反应的热循环参数为：94 ℃预变性2 min，然后94 ℃变性45 s，退火45 s，72 ℃延伸60 s，共35个循环，最后72 ℃延伸10 min。得到的PCR产物置于质量浓度为30 g/L的琼脂糖凝胶电泳中进行初步检测，判断产物的有无。

表2 21对SSR引物序列信息

PCR产物的电泳检测：准备洁净的2块玻璃板和等长的1 mm厚梳子，用于质量浓度为80 g/L的非变性聚丙烯酰胺凝胶的制备(见表3)。待凝胶完全凝固后，吸取2～3 μL扩增产物，与1 μL的上样缓冲液均匀混合后点入上样孔，于200 V恒定电压下直至指示剂中的二甲苯青移动至胶的2/3处时，停止电泳(约70 min)。之后，将聚丙烯酰胺凝胶放入预先配置好的约300 mL染色液(质量浓度为2 g/L的AgNO3、体积分数1%的冰乙酸、体积分数10%的无水乙醇)中，在摇床上摇动20 min，至电泳示踪液消失后，倒入足量蒸馏水，清洗2次，每次15 s，取出沥水。最后加入现用现配的显影液(质量浓度为30 g/L的NaOH、体积分数为0.5%的甲醛)300 mL，轻摇8 min，至目的条带出现后拍照记录各样品的条带情况。

表3 质量浓度为80 g·L-1的非变性聚丙烯酰胺凝胶制备配方

1.3 数据处理

矩阵图建立：采用人工数带方式，将电泳结果转换成电子图谱，根据电子图谱制作0/1二维矩阵，多态性位点无条带则记为0，有条带则记为1，在Excel软件中建立等位基因矩阵图。

多态性条带比率(Rpp)：Rpp=a/b，a为多态性条带数、b为条带总数。

遗传相似性：利用NTSYS2.0.1软件，通过非加权组平均法(UPGMA)聚类分析实现。

基因片段长度：以DNA分子标准物(DL2000)片段长度对数值为纵坐标，对应的条带迁移距离为横坐标，绘制DNA片段长度的标准曲线。不同等位基因的迁移距离用直尺测量后，带回标准曲线，得到较为准确的各等位基因片段长度的数值。

各品种杨树的二维码：将各品种自详细的遗传背景、引物信息、等位基因片段长度等信息录入二维码。

2 结果与分析

2.1 SSR扩增结果及多态性

利用21对SSR引物，对40份样品的基因组DNA进行PCR扩增，最终筛选出18对扩增效率高、稳定性好、多态性丰富、特异性高的SSR引物，进行供试材料的指纹图谱构建及遗传关系分析，引物编码见表2。

利用选定的18对引物对40个杨树品种基因组DNA进行PCR扩增，经非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，得到相应的扩增条带。试验共获得多态性条带101条，平均每个引物扩增出5.61条，多态性比率为100%。其中，引物PMGC_2030扩增出10条条带，数量最多，引物PN1297275、PMGC_2885均扩增出3条条带，数量最少，扩增产物的片段长度处于34～393 bp之间。引物PMGC-2679、PMGC_649、PMGC_2030、ORPM_248的电泳结果如图1所示，各引物对40个样品的扩增情况见表4。

A为引物PMGC-2679、B为引物PMGC_649、C为引物PMGC_2030、D为引物ORPM_248；M为DNA分子标准物(DL2000)；从左至右1～40为杨树样品序号，顺序同表1。

试验结果显示：不同品系分离得到的条带的数量及所在位置不同，同一品系利用不同引物扩增出的条带也有所不同。说明利用这18对引物，可以将供试的40个杨树品种区分开，实现了分子水平上各品种的辨别。

2.2 40个杨树杂交品种的指纹图谱构建与分子二维码的建立

图2为引物PNI297272、PNI297275的分子片段长度标准曲线。分析18对引物的分子片段长度标准曲线，其R2均在0.966 9～0.976 9之间，拟合度极好，可用于已知品种等位基因分子片段长度的计算。

依据引物分子片段长度标准曲线计算有效条带对应的等位基因的分子片段长度，绘制 40个杨树品种的指纹图谱(见表5)。为40个杨树品种建立各自的专属二维码，具体信息包括：品种名称、遗传背景、拉丁名、品种类型、品种权人，以及利用试验选用的18对引物进行SSR扩增后的产物片段数量和片段长度共7类信息(见图3)。

表4 18对引物的扩增结果

2.3 杨树杂交品种的遗传相似性

将统计出的40个试验材料的0/1矩阵图进行格式处理，利用Ntsys软件进行遗传相似性分析(见表6)。40个杨属品种(系)的遗传相似系数的变化范围在0.48～0.89之间，遗传相似系数较好地反应了各品种(品系)亲缘关系的远近。

杂交亲本分别为同一种的品种(品系)，其遗传相似系数较大。如1302、1307、1309、1305均为小叶杨与黑杨的杂交子代，其中1302与1307、1309的遗传相似系数均为0.89，表明利用筛选的18对引物，通过SSR方式， 1302获得的分子指纹图谱与1307、1309的指纹图谱相似性极强，区分度最弱；1307与1309的遗传相似系数为0.86，说明二者的相似性较其与1302的相似性稍弱些，区分度稍强些。而对于相同遗传背景的1305与1302、1307、1309的遗传相似系数分别为0.81、0.82、0.80，通过SSR指纹图谱进行区分，辨识度要更强一些。

同样为小叶杨与黑杨杂交子代的8804、1310、1301、1303，彼此间的遗传相似系数均在0.73以上，SSR指纹图谱的相似性也较强。

由表6可见，同样为小叶杨×黑杨的遗传背景下，1309与8804、1305与8804、1309与1310、1302与1310的遗传相似系数，分别为0.59、0.61、0.62、0.63。SSR的指纹图谱相似性较弱，容易区分。

a为引物PNI297272的曲线；b为引物PNI297275的曲线。

表5 40个东北地区杨树种的指纹图谱

续(表5)

图3 40个杨树品种SSR扩增片段二维码

由表6可见，柔毛杨(原变种)(C38)和波兰15号杨(C39)与其他品种(品系)的遗传相似系数较小。具体为：柔毛杨与甜×俄(C18)的遗传相似系数为0.49，与A118(C7)、香94(C10)、J7(C12)的相似系数均为0.51；波兰15号杨(C39)与A118(C7)的遗传相似系数为0.48，其与大青×健(C8)、斯大林工作者(C14)、斯×施(C16)的遗传相似系数均为0.51。柔毛杨和波兰15号杨，分别属于青杨派原种和黑杨派杂种，2个品种与具有相同派别遗传背景的品系的遗传相似系数均较小，易于分辨。

表6 40个杨树品种间的相似系数

续(表6)

品种编号C21C22C23C24C25C26C27C28C29C30C31C32C33C34C35C36C37C38C39C40C1︙C20C211.00C220.831.00C230.770.761.00C240.610.580.661.00C250.620.630.710.731.00C260.740.690.730.630.681.00C270.660.750.750.650.680.741.00C280.640.610.630.770.680.620.681.00C290.680.630.650.730.680.640.680.781.00C300.630.660.640.720.650.590.710.730.871.00C310.710.680.660.740.650.670.710.850.790.801.00C320.690.620.620.600.570.690.610.570.650.600.661.00C330.660.610.670.610.620.620.680.600.620.610.670.771.00C340.690.680.680.680.610.670.710.650.710.740.660.780.731.00C350.660.650.670.670.600.640.700.660.720.730.630.730.740.891.00C360.750.720.620.620.570.670.610.610.730.680.700.800.710.820.811.00C370.630.640.680.660.590.650.650.590.690.720.620.720.750.860.890.80 1.00C380.640.570.550.550.680.580.600.520.640.590.590.650.660.630.620.690.611.00C390.600.550.570.630.660.540.620.580.620.570.530.610.600.630.640.590.570.721.00C400.740.690.710.630.600.680.660.600.640.650.610.710.740.790.800.730.810.610.661.00

对40个试验样品的遗传相似系数进行聚类分析，绘制聚类分析树状图(见图4)。首先，父母本分别为同种的杂交杨树品种聚为一类，如1307、1302、1309、1305父本均为小叶杨、母本均为欧洲黑杨，此4个品种为一组；8804、1310、1301、1303父本均为小叶杨，母本均为欧洲黑杨，这4个品种为一组；然后，遗传相似系数处于0.74左右的品种再聚为一类。聚类过程中，母本效应显著，即相同母本的杂交品种首先聚为一类，再依据父本之间的遗传差异形成不同的聚集情况，以白城2号杨(C4)、白城5号杨(C5)、白城小黑杨(C6)为例，白城2号杨(C4)和白城5号杨(C5)的父母本相同，则先在0.75水平聚为一类，再与母本相同而父本不同的白城小黑杨(C6)在0.73水平聚为同类。聚类分析表明，父母本均为同一种的杂交品系在较大遗传相似系数的位置上聚为一类，父母本中有一方为相同种的物种间遗传相似性系数也基本在0.73的水平上聚为一类，且母本效应高于父本效应。若一个杨树品种的父本与另一品种的母本是相同品种树种时，它们二者间的遗传相似性也高于那些父母本完全不同的杂交品系。

图4 40个杨树品种的聚类分析

3 讨论

品种的遗传相似系数与遗传背景密切相关。通常，品种的遗传背景越相似，它们的遗传相似系数越接近1。本研究中选取的40个杨属杂交品种中，有34个是以小叶杨或黑杨为单一亲本或父母本的，有15个是小叶杨×黑杨的杂交子代，表型相似性较强，分子水平上遗传相似系数普遍较大。本研究中，白城小黑杨同样是小叶杨×黑杨的杂交种，但该品种与其它小叶杨×黑杨杂交种的遗传相似系数均较小，数值为0.56～0.74。其原因是，小叶杨与黑杨的杂交种，其父母本虽为同一种，但作为其亲本的小叶杨或欧洲黑杨极可能为不同种源或相同种源的不同家系、不同单株，地理分布上的远缘性或种源内家系间的遗传多样性，均有可能导致了分子水平上遗传相似系数相对较小。在相关研究中，山杨[18]和密叶杨[19]等杨属不同种，均表现出种源间或居群间遗传变异远低于种源内或居群内个体间的遗传变异。因此，推断无论是否为相同种源，只要是不同的小叶杨或黑杨亲本个体，便可导致其杂交种后代遗传相似性的巨大差异。

传统的形态学鉴别，对于植物分类学、林木遗传育种以及表观遗传学领域的研究者颇为容易，却不具有大众范围的普适性。杨树天然杂交普遍，人工杂交容易，仅凭外部形态进行辨种识种，专业性强，且受环境影响巨大，SSR分子标记技术的出现与普及，极好地解决了这一问题，该技术将在品种鉴别、良种保护等方面得到越来越广泛的应用。

4 结论

本研究以东北地区可广泛栽培的已知杨树品种为研究对象，利用筛选出的18对引物，对其进行SSR扩增分析，从DNA分子的角度上对40种试验材料进行了鉴定辨别。同时利用试验结果形成了相应的DNA指纹图谱，并进行了遗传相似性分析与聚类分析，建立了40个已知品种的二维码，丰富了杨属分子基因库信息，为后续品种名录的建立与品种保护等工作奠定了基础。