运用SNP芯片评估马身猪保种群体的遗传结构

蔡春波，张雪莲，张万峰，杨 阳，高鹏飞，郭晓红，李步高，曹果清

(山西农业大学动物科学学院，太谷 030801)

遗传多样性是指一个物种遗传组成中遗传特征的总数。遗传多样性在群体适应环境变化的过程中起着十分重要的作用，群体的遗传多样性越丰富，其适应环境变化的能力越强，生存能力也就越强[1-3]。SNP是最常见的一种遗传多样性，其数量多，而且分布密集。通过比较分析种群内个体的SNP位点，可以鉴定种群的遗传多样性、亲缘关系和家系结构[4-5]。SNP芯片即单核苷酸多态性微阵列，是将数百万个DNA标记序列排列并固定在特殊的硅片上，形成SNP探针微阵列[6]。SNP芯片的工作原理是通过固定在芯片上的DNA标记序列与目标基因组发生碱基互补配对反应，从而精准地鉴定目标基因序列中的SNP位点。随着SNP芯片价格的降低和筛选速度的加快，SNP芯片技术的使用越来越广泛，已经成为鉴定SNP位点最为高效的技术[7]。在猪种质特性和群体遗传多样性的研究中，SNP芯片技术的应用也非常广泛[8-9]。Wang等[10]利用SNP芯片技术检测了6个太湖猪群体的SNP位点，分析了6个太湖猪种群的遗传多样性，结果表明，梅山猪的遗传多样性最丰富，枫泾猪的遗传多样性最低。黄树文等[11]利用SNP芯片技术分析了广东地方猪种的遗传多样性，结果表明，两广小耳猪、大花白猪和蓝塘猪的遗传多样性都比较低，需要引入新的血统，扩大其遗传多样性。

马身猪是山西省地方猪种，属于黄淮海黑猪类型，具有优良的种质特性。马身猪长期生活在生态条件恶劣的高原地带，造就了马身猪独特的遗传特性和良好的适应性。马身猪耐粗饲，适应性强，抗寒性能突出，在高寒低营养水平下仍能正常繁殖。马身猪肉质细嫩，肉味鲜美，属于高肉质猪种。马身猪背最长肌中肌内脂肪和鲜味氨基酸的含量都明显高于大白猪[12]。但是马身猪的缺点也非常明显：生长速度慢、瘦肉率低和脂肪含量高。马身猪的平均日增重、6月龄体重和瘦肉率都要明显低于大白猪[12]。马身猪的许多基因具有多态性，其剪切体和表达模式也与其他猪种存在显著的差异，具有独特的种质特性[13-17]。马身猪和大白猪的背最长肌中存在非常多的差异表达基因和lncRNA，主要富集在骨骼肌生长发育、脂肪酸合成、能量代谢和肌纤维类型发育等生物学过程中，这可能是马身猪生长速度慢和肉品质高的遗传基础[18-19]。马身猪肠道中，纤维杆菌、普氏菌和乳酸杆菌的丰度较高，而这些菌种都可以促进纤维素的降解，这可能是马身猪耐粗饲的遗传基础[20-22]。马身猪肠道中，假丁酸弧菌和魏斯氏菌的丰度较高，而这些菌种都可以激活机体的免疫反应，这可能是马身猪抗病性强的遗传基础[20-22]。作为重要的遗传种质资源，马身猪在我国猪育种工作中发挥了重大的作用。以马身猪为杂交亲本，先后培育出山西黑猪、山西白猪高产仔母系[23]和国家级新品种晋汾白猪[24]，丰富了中国猪种的多样性。

虽然马身猪具有肉品质高和抗病性强的优势，但是其生长速度慢和瘦肉率低，无法满足市场需求，导致马身猪的数量越来越少，近亲繁殖现象严重，遗传多样性逐渐降低，急需加强保种。SNP芯片技术可以通过鉴定群体中单独个体的SNP位点，分析该群体的遗传多样性、亲缘关系和家系结构。因此，本研究利用SNP芯片技术鉴定马身猪保种群体中单独个体的SNP位点，分析保种群体的遗传多样性、亲缘关系和家系结构，评价马身猪的保种效果，为马身猪的保种提供科学的指导和建议。

1 材料与方法

1.1 试验动物

保种马身猪均来自于山西北方四季牧场，共39头 种猪，其中20头公猪、19头母猪，饲养标准和环境条件一致。仔猪全部在28 d断奶。采集39头种猪的耳组织样品，放入冻存管中，迅速置于液氮中保存。

1.2 主要试剂与仪器

主要试剂：Biowest琼脂糖、50×TAE缓冲液、核酸染料、DNA上样缓冲液、Tris饱和酚、氯仿、异戊醇和蛋白酶K粉末均购自索莱宝公司；Trans 2000 plus Marker购自TaKaRa公司。主要仪器：高压蒸汽灭菌锅(MLS-3020，Sanyo)，制冰机(SIM-F124，Sanyo)，核酸蛋白浓度测定仪(ND-1000，NanoDrop)，高速冷冻离心机(Centrifuge 5415R，Eppendorf)，电泳槽(Mini Trans-Blot Cell Module，Bio-Rad)，电泳仪(DYY-3，六一仪器厂)，核酸蛋白凝胶成像系统(Universal HoodⅡ，Bio-Rad)。

1.3 马身猪保种群体基因组DNA的提取和鉴定

采用酚/氯仿抽提法提取马身猪耳组织的基因组DNA：剪碎耳组织样品，加入蛋白酶K溶液裂解，再加入酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)的混合液萃取基因组DNA，然后加入无水乙醇沉淀基因组DNA，最后加入TE缓冲液溶解基因组DNA，-20 ℃保存备用。通过核酸蛋白浓度测定仪测量基因组DNA的浓度和OD值，采用琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA的完整性。

1.4 马身猪保种群体基因组DNA的SNP分型

所有的基因组DNA样品均委托康普森生物技术有限公司进行SNP芯片检测，均采用Illumina CAUPorince 50 K SNP芯片进行基因型分型。基因型分型试验流程：NaOH溶液对基因组DNA进行碱变性，恒温过夜进行基因组全扩增，酶切进行DNA片段化，DNA沉淀和重悬，SNP芯片杂交，芯片清洗，单碱基延伸染色，芯片扫描，最后通过iScan扫描系统读取数据。

1.5 SNP芯片数据质控

按照以下质量控制标准筛除不合格的样本和SNP位点：只使用常染色体上的位点，最小等位基因频率大于0.05，哈代温伯格平衡检验的P值大于10-6，检出率大于90%的SNP位点。

1.6 Plink软件分析马身猪保种群体的遗传多样性

采用Plink(V1.90)软件对质控后的数据进行分析，分别计算马身猪保种群体的最小等位基因频率、期望杂合度、观察杂合度、多态信息含量和多态性标记比例，分析马身猪保种群体的遗传多样性。最小等位基因频率是指群体内某个位点上不常见的等位基因发生的频率，反映一个群体中基因的多样性，范围在0～0.5之间。期望杂合度是指群体中任一个体的任一位点杂合的概率，是反映群体遗传变异的指标之一。观察杂合度是指群体中某一位点是杂合子的个体数占总个体数的比例。多态信息含量表示一个后代所获得的某个等位基因标记来自于其父亲或母亲的可能性，与群体中等位基因的数目和频率有关，用来表示群体中某一位点多态性的程度，评估群体的遗传多样性。

1.7 Plink软件分析马身猪保种群体的亲缘关系

采用Plink(V1.90)软件分析连续性纯合片段(runs of homozygosity，ROH)，统计每头马身猪ROH的分布、长度和数目，计算每个个体中ROH片段总长度与常染色体基因组总长度的比值，此比值即为基于ROH的近交系数。采用Plink(V1.90)和Gmatix(V2)软件分别构建状态同源(identity by state，IBS)距离矩阵和G矩阵，并绘制热图，分析保种群体的亲缘关系。IBS是指两个个体中共有的等位基因序列相同，IBS的遗传距离可以衡量样本间的相似性，评价其亲缘关系。G矩阵是利用SNP位点构建的基因组关系矩阵，更能真实地反映个体间的亲缘关系。

1.8 Mega X软件分析马身猪保种群体的家系结构

采用Mega X (V10.0)软件对质控后的SNP位点进行分析并绘制群体进化树，分析马身猪保种群体中种公猪的家系结构，统计不同家系种公猪的数量。进化树分析是把关系密切的个体聚类到一个较小的分类单元，关系相对疏远的个体聚类在一个较大的分类单元，最后把整个分类系统画成一张系谱图，展示所有样品间的亲疏关系。

2 结 果

2.1 基因组DNA检测

采用酚/氯仿抽提法提取马身猪保种群体的耳组织基因组DNA，检测所有DNA样品的浓度和OD值，结果显示，每份DNA样品的浓度均大于50 ng·μL-1， OD260 nm/OD280 nm为1.7～1.9，表明DNA样品的浓度和纯度均符合要求。对基因组DNA样品进行琼脂糖凝胶电泳(图1)，结果显示，DNA条带清晰，无拖尾现象，亮度均一，说明基因组DNA样品质量较好，无蛋白质污染，也无降解，达到Illumina的分析要求，可以用于后续研究。

2.2 马身猪保种群体基因组DNA的SNP分型及质控

使用Illumina CAUPorcine SNP 50 K SNP芯片对基因组DNA样本进行基因分型和质控，结果见表1。39头马身猪保种群体中共检测到43 832个SNPs位点，个体的基因型检出率为0.977 5～0.981 6，平均值为0.980 1，表明该SNP芯片适合分析马身猪基因组的SNP位点；通过质量控制的SNPs数目为28 859个，在染色体上的分布情况如图2所示，1号染色体的SNP数目最多，为4 529个；18号染色体的SNP数目最少，为970个。

表1 SNP质量控制统计

2.3 马身猪保种群体的遗传多样性分析

采用Plink(V1.90)软件计算马身猪保种群体的最小等位基因频率、期望杂合度、观察杂合度、多态信息含量、多态性标记比例。39头保种马身猪中共检测到了60.97个有效等位基因，平均有效等位基因数为1.563 4。最小等位基因频率为0.258，其分布比较均匀(图3A)。SNP位点的多态信息含量为0.093～0.593，平均多态信息含量为0.412，分布情况如图3B所示，其中，26 036个SNPs位点的多态信息含量大于0.25，为中度多态性SNP位点。SNP位点的多态性标记比例为0.724，表明72.4%的SNP位点具有多态性，说明马身猪的遗传多样性比较丰富。平均观察杂合度为0.354 1，平均期望杂合度为0.349 9，平均观察杂合度略高于平均期望杂合度，但两者之间相差不多，表明马身猪保种群体出现了分化。

2.4 马身猪保种群体的IBS距离矩阵分析

通过Plink(V1.90)软件计算39头保种马身猪之间的IBS遗传距离，结果显示，马身猪保种群体的IBS遗传距离在0.126 3～0.407 7之间，平均为0.284 2；20头保种公猪的IBS遗传距离在0.150 1～0.387 1之间，平均为0.285 2。马身猪保种群体IBS距离矩阵的结果如图4所示，大部分马身猪个体间的IBS遗传距离较远，呈中等程度的亲缘关系(图4中颜色较深的方格)；部分个体间的IBS遗传距离较近(图4中颜色较浅的方格)，存在较高的亲缘关系，说明马身猪保种群体存在较大的近交风险，必须强化选配措施。

2.5 马身猪保种群体的G矩阵分析

利用SNP位点构建的基因组关系G矩阵进一步分析马身猪保种群体的亲缘关系，结果如图5所示。大部分马身猪个体间呈中等程度的亲缘关系(图5中颜色较浅的方格)，而部分个体之间存在较近的亲缘关系(图5中颜色较深的方格)，与IBS距离矩阵结果一致，均表明马身猪保种群体存在近交风险。

2.6 马身猪保种群体的ROH分析

在39头马身猪保种群体中共检测到8 131个ROHs片段，长度在10～20 Mb之间的ROH数量最多，占41.98%(图6A)，其中，最短的ROH的长度为5.51 Mb，含有104个SNPs，位于9号染色体上；最长的ROH的长度为156.64 Mb，含有2 100个SNPs，位于13号染色体上。ROH的分布比较均匀，1号染色体上的ROH数量最多，为98个；18号染色体上的ROH数量最少，为26个(图6B)。每头马身猪的ROH总长度在258.55～1 045.91 Mb 之间，平均ROH总长度为580.48 Mb，ROH总长度在400～600 Mb之间的个体数最多，共有18头(图6C)。马身猪保种群体基于ROH的平均近交系数为0.237，表明马身猪保种群体出现了近交现象。

2.7 马身猪保种群体中公猪的家系结构分析

公猪的家系建立在整个保种群体中具有极高的重要性，本研究采用Mega X (V10.0)软件绘制20头 种公猪的群体进化树。结果如图7所示，现有的20头种公猪可以分为3个家系，分别命名为家系A、家系B和家系C，分别含有11、2和7头种公猪。然后根据39头保种马身猪的亲缘关系远近程度，最终将整个保种群体分为3个家系(表2)，家系A含有11头公猪和15头母猪，家系B含有2头公猪和2头母猪，家系C含有7头公猪和7头母猪。部分母猪存在交叉现象，同时被归到不同的家系中，例如母猪174F和541F同时被归到A和C家系中，母猪218F同时被归到B和C家系中，母猪402F同时被划分到A、B和C家系中。

3 讨 论

科学评估保种效果是保种工作的重要组成部分，目前多数研究采用微卫星标记技术分析保种群体的遗传多样性，评估保种效果[25-27]。张跟喜等[28]选择21个微卫星标记分析边鸡的遗传多样性，经过一个世代的选育，边鸡的多态信息含量和期望杂合度都维持在原有水平，说明采用的保种方法很好地保存了边鸡的遗传多样性。与微卫星标记相比，全基因组SNP标记可以更加客观地反映个体之间的遗传差异，被越来越多地应用于分析群体的遗传多样性[29-30]。Muoz等[31]使用高密度SNP芯片评估了20个欧洲驯化猪种和西班牙野生猪种的遗传多样性，结果发现，野生猪种与驯化猪种之间的遗传距离较近，野生猪种出现了明显的分化，需制定措施保护野生猪种的遗传多样性。Diao等[32]采用SNP芯片技术分析了中国华南地区11个猪种的遗传学多样性和猪种间的亲缘关系，为中国地方猪的科学保种提供了基础数据。SNP芯片技术分析种群的遗传多样性，准确率高，而且价格较低，应用非常广泛。

期望杂合度是指群体中任一个体的任一位点发生杂合的概率，观察杂合度是指群体中某一位点是杂合子的个体数占总个体数的比例。本研究中，马身猪保种群体的平均观察杂合度高于平均期望杂合度，表明所检测马身猪保种群体历史上可能出现了分化，或者引进了小部分外来的血缘，需要继续加以纯化。IBS是指两个个体中共有的等位基因序列相同，群体之间的IBS遗传距离可以衡量样本间的相似性，评价其亲缘关系。刘彬等[33]报道,青峪猪保种群体的平均IBS遗传距离为0.260 4±0.025 2，其中，公猪的平均IBS遗传距离为0.263 3±0.023 7，公猪的平均IBS遗传距离略高于整个群体。本研究发现，马身猪保种群体的平均IBS遗传距离为0.284 2±0.046 5，公猪的IBS平均遗传距离为0.285 2±0.050 1，公猪的平均IBS遗传距离也略高于整个马身猪保种群体。1头种公猪会与多头母猪交配，因此种公猪的选择标准比较严格。被挑选的种公猪一般都来自于不同的家系，亲缘关系也较远，尽量降低后代群体的近交系数，因此群体种公猪的平均IBS遗传距离略高于整个马身猪保种群体。

表2 马身猪家系表

PIC是指某一标记在群体中出现多态性的频率，可以用来评估群体的遗传多样性。2010年，曹果清等[34]利用FAO-ISAG推荐的21个微卫星标记检测马身猪遗传多样性变化趋势发现，马身猪保种群体的PIC值在0.341～0.441之间，平均值为0.392。本研究基于SNP芯片分析了马身猪保种群体的遗传多样性发现，72.4%的SNPs位点具有多态性，且各位点PIC值在0.093～0.593之间，平均PIC为0.412。本研究中的PIC值略高，表明马身猪保种过程中遗传多样性没有明显丢失，说明近几年的保种措施有效。但是基于ROH的近交程度[35-36]分析表明，马身猪保种群平均近交系数为0.237，近交系数较高，容易出现近交衰退，应引起高度重视。由于我国地方猪种群体规模的局限性和相对封闭的运行模式，随着保种时间的延长和世代重叠的加剧，群体内近交系数的上升和遗传结构发生变化是必然趋势[37-38]。青峪猪经过世代闭锁繁育，平均近交系数达到了5.5%，各世代群体近交系数由F1世代的0.039上升到F3世代的0.075[33]。降低近交系数的有效办法是扩大群体含量，并进行适当选配，同时加强管理，避免系谱记录不完整或者错误而导致的近亲繁殖。本研究还发现，马身猪保种群体仅由3个家系构成，且3个家系的公、母猪数量相差较大，家系结构不平衡。因此，该马身猪保种场需要从原种场引入新的血统，扩充核心群，并实施合理选配，避免近亲繁殖，维持马身猪保种群体的遗传多样性。

中国地方猪种的商品化程度较低，保种群体的数量也较少，容易出现近亲繁殖，导致保种群体的遗传多样性降低。目前，大部分中国地方猪保种场仍然根据谱系进行配种和保种，方法较为单一和落后，需要更加科学和先进的方法指导保种工作。SNP芯片技术可以鉴定保种群体中每个个体的SNP位点，从而分析保种群体的遗传多样性、亲缘关系和家系结构，然后结合谱系合理地制定配种方案，维持保种群体的遗传多样性。通过SNP芯片技术鉴定的SNP位点，首先经过质量检测，确定质控后的SNP位点；然后根据质控后SNP位点的个数和位置，分别计算有效等位基因数、最小等位基因频率和多态信息含量，分析保种群体的遗传多样性；计算保种群体的平均观察杂合度和期望杂合度，分析保种群体的变异程度；计算保种群体中各个体之间的IBS遗传距离，同时构建保种群体中各个体之间的基因组关系G矩阵，分析保种群体间的亲缘关系；计算保种群体中每个个体的ROH，然后基于ROH计算保种群体的平均近交系数，同时绘制群体进化树，把保种群体分为不同的家系；最后结合SNP芯片分析家系结构和保种场记录的谱系，制定合理的配种方案，科学地进行保种工作。本研究通过分析SNP芯片数据，建立了较为完整的保种群体遗传多样性、亲缘关系和家系结构的分析方法，为马身猪的保种工作提供了科学的依据。

4 结 论

本研究基于Illumina CAUPorince 50 K SNP分析了马身猪保种群体的遗传多样性，发现马身猪群体遗传多样性较丰富，平均PIC为0.412，呈中度多态；群体内家系少，近交程度较高，各家系个体数差异明显，需要从原种场引入新的血统，扩大群体含量，降低近交系数，并关注各家系数量，确保家系结构维持平衡。