基于网络药理学研究皂角刺治疗乳腺癌的作用机制

权 琦 陈 平 黄圆圆 张 蓓

中山大学肿瘤防治中心中医科，广东广州 510060

乳腺癌是女性最常见的肿瘤。2018年全球乳腺癌新发病例数为208.9万，死亡人数为62.7万，均居女性恶性肿瘤第1位[1]。晚期乳腺癌的治疗方式为化疗、放疗及靶向治疗，但治疗相关不良反应多，影响患者的生活质量。中医药治疗乳腺癌在扶正、祛邪、调动机体抗病能力、减轻其他治疗的副作用方面有独特优势。中药联合放化疗能提高患者的治疗有效率、减轻不良反应、改善生活质量[2-3]。

皂角刺（Gleditsiae Spina）始载于《本草衍义补遗》，性温味辛，归肝、肺、胃经，具有消肿托毒、排脓、杀虫等功效[4]。现代药理研究发现，皂角刺中黄酮类成分在多种实体瘤中有抑制肿瘤生长的作用，皂角刺单药或联合其他中药对人乳腺癌细胞有具有细胞毒活性[5-6]。目前关于皂角刺抗肿瘤作用的研究主要集中在细胞或动物实验层面，缺乏更深层的机制研究。

网络药理学是将药物作用靶点和疾病靶点结合，建立疾病、靶点、药物及通路之间的相互作用网络，从而全面系统地分析药物的作用机制[7]。网络药理学可系统揭示中药的活性成分及作用机制，反映中药“多成分-多靶点-多途径”的特点，与中医治疗疾病的整体观念和辨证论治理论相一致[8]。本研究运用网络药理学方法分析皂角刺治疗乳腺癌的潜在关键靶点及通路，为进一步深入研究提供依据。

1 材料与方法

本研究流程见图1。

图1 预测皂角刺治疗乳腺癌作用机制流程图

1.1 皂角刺活性化学成分及作用靶点

在Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database（TCMSP）[9]中，以“皂角刺”为关键词，口服生物利用度≥30%和类药性≥0.18 为筛选条件，得到活性较高的化合物，并查询对应的靶点。

1.2 乳腺癌的相关疾病靶点

在Genecards[10]及Online Mendelian Inheritance in Man（OMIM）[11]中，以“breast cancer/carcinoma/neoplasms”为关键词，检索乳腺相关的靶基因。

1.3 基因映射

利用Venn Diagram 数据包将皂角刺活性化学成分所对应的靶点与乳腺癌相关靶点取交集，得到共同靶点。

1.4 构建PPI

借助String 数据库平台[12]构建PPI，获取靶蛋白相互作用关系图。

1.5 GO功能富集分析和KEGG通路富集分析

使用R语言对皂角刺和乳腺癌共同靶点进行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析，得到皂角刺治疗乳腺癌涉及的关键功能及通路。

1.6 构建“成分-靶点”和“靶点-通路”网络

将共同靶点导入Cytoscape 软件，构建“成分-靶点”网络图。将关键通路和富集在该通路中的蛋白导入Cytoscape 软件，构建“靶点-通路”可视化网络，并提取关键靶点涉及的子网络。

2 结果

2.1 皂角刺的化学成分及靶点结果

筛选得到高活性化合物11个（表1），对应的靶点174个。

1.3 稻瘟病抗性基因的分子标记 利用Pi-ta、Pi-b、Pi54和Pi21抗性基因引物检测材料，引物名称、序列及其扩增片段预期大小见表 1。

表1 皂角刺含有的11种活性化合物基本信息

2.2 乳腺癌的相关疾病靶点结果

Genecards 数据库和OMIM 数据库分别检索出乳腺癌相关的疾病靶点1053 和527个。去除重复的共1132个。

2.3 基因映射结果

将皂角刺活性化学成分所对应的靶点与乳腺癌的疾病相关靶点进行映射，得到映射靶点88个（图2）。

图2 皂角刺活性成分-抗乳腺癌作用靶点韦恩图

2.4 PPI

通过String 平台获得PPI网络（图3A），筛选出前30名的关键靶点（图3B）。

2.5 GO功能富集分析和KEGG通路富集分析结果

以P＜0.01 为筛选标准，获得GO 生物学过程条目104条，KEGG 相关信号通路144条。GO富集结果提示，皂角刺作用于乳腺癌涉及的分子功能主要包括：细胞因子受体结合、DNA 结合转录激活剂活性和RNA 聚合酶Ⅱ特异性激酶调节活性、受体配体活性、泛素样蛋白连接酶结合、激酶调节活性等（图4A）。KEGG通路富集结果提示，靶点主要富集于各种癌症、感染、细胞凋亡和TNF信号通路等（图4B）。

图3 PPI

2.6 构建“成分-靶点”和“靶点-通路”网络结果

在“成分-靶点”网络图中（图5），网络拓扑结构分析得出各节点degree值，排名前5位的化合物是：槲皮素（quercetin）、非瑟酮（fisetin）、山奈酚（kaempferol）、β-谷甾醇（beta-sitosterol）、豆甾醇（stigmasterol）。“靶点-通路”网络图中（图6）中，关键靶点有3个富集在关键通路中，靶点依次为：MAPK1、AKT1、RELA，通路包括癌症、细胞凋亡、TNF信号通路、感染、IL-17 信号通路和内分泌抵抗。

图4 GO功能富集分析和KEGG通路富集分析

3 讨论

本研究通过网络分析获得3个关键化合物：槲皮素、非瑟酮和山奈酚，均为黄酮类化合物。皂角刺中的黄酮类化合物能从多个方面抑制乳腺癌的发生和发展[13]。有研究报道，槲皮素能将肿瘤细胞周期阻滞在S期并导致肿瘤细胞凋亡[14]。非瑟酮可以激活半胱氨酸蛋白酶，抑制AuroraB 激酶，促进乳腺癌细胞凋亡[15]。Azevedo 等[16]报道，山柰酚对人乳腺癌MCF-7 细胞有抗增殖和细胞毒效应。由此可见，皂角刺中多种活性成分可抑制乳腺癌细胞生长，从而发挥治疗乳腺癌的作用。

本研究结果显示，MAPK1、AKT1、RELA是皂角刺治疗乳腺癌的关键靶点。MAPK1 又称ERK2，是Ras/Raf/ERK 通路中较为重要的因子，ERK2 蛋白在乳腺癌中阳性表达率较高[17]，可通过促进细胞凋亡、血管新生和介导耐药等促进肿瘤发展，抑制ERK2是一种具有潜力的治疗靶点。AKT 在乳腺癌等多种恶性肿瘤中以异常活化形式存在，可促进肿瘤细胞增殖，是抗乳腺癌药物研发的重要靶点[18]。核因子RELA（p65）是NF-κB家族成员，在受到信号刺激进入细胞核后调控下游基因，激活细胞核内基因的转录功能引起细胞增殖。研究表明，沉默p65 基因可使乳腺癌细胞增殖受抑制，并能够引起细胞凋亡，P65 蛋白在乳腺癌组织中阳性表达率较高，且与不良预后密切相关[19-20]。

图5 “成分-靶点”网络

图6 “靶点-通路”网络图

根据本研究结果预测皂角刺治疗乳腺癌的作用机制为：槲皮素、非瑟酮、山奈酚，通过靶向癌症、细胞凋亡、TNF信号通路、感染、IL-17信号通路和内分泌抵抗等通路的MAPK1、AKT1、RELA 靶点起作用。

本研究利用生物信息学大数据分析的优势，通过相关网络图的构建直观地显示皂角刺治疗乳腺癌具有多靶点、多途径共同作用的特点。研究结果为一种分子机制上的预测探讨，具体作用机制的确认需进一步验证。在后续研究中拟进一步探讨皂角刺在复方用药中抗乳腺癌的作用机制，并对核心靶点和机制进一步做实验验证，为皂角刺在乳腺癌治疗中的作用提供更有效、更深入的论证。