半夏白术天麻汤物质基准HPLC指纹图谱及多成分定量分析

王淑玲 杨彗敏 李敏慧 徐 男 门连汇 王 悦 顾郁欣 白 雪 田 朝

1.杭州师范大学医学院，浙江杭州 310012；2.山东省中医药研究院，山东济南 250014

半夏白术天麻汤是2018年国家中医药管理局首批发布的100 首经典名方之一，目前还未发现现代中成药品种已上市的情况，经典名方大多为传统的汤剂，受药材基源、饮片质量、煎煮方法等因素的影响，如何确保其制备方法与传统方法保持一致，是经典名方研究成败的关键性核心问题[1-2]。中药指纹图谱技术对于获取整体特征性化学成分的结构、相对组成以及浓度分布等信息起着至关重要的作用，中药指纹图谱技术已经成为中药制剂质量稳定性、生产一致性、质量定性定量鉴别考察的可行方法[1-2]，是目前普遍采用的既科学又合理的一种方法[3]。半夏白术天麻汤所含的重要活性成分主要是天麻素、甘草苷、柚皮苷、橙皮苷、异甘草苷、白术内酯Ⅲ、甘草次酸[4-6]。本研究采用HPLC指纹图谱法建立半夏白术天麻汤中重要成分的含量测定方法，同时对所含7种指标成分进行定量测定，旨在为系统研究半夏白术天麻汤的“物质基础”及研发经典名方制剂一致性评价提供参考和依据，现报道如下。

1 仪器与材料

1.1 仪器

U-3000 HPLC 二极管阵列检测器（赛默飞世尔科技公司）；FA1110 十万分之一电子分析天平（上海精密科学仪器有限公司）；METTLER AE 242型万分之一电子分析天平（梅特勒-托利多国际贸易有限公司）；LXJ-Ⅱ型离心机（上海医疗器械股份有限公司）。

1.2 材料

18批半夏白术天麻汤药材（如半夏、天麻、白术、橘红、茯苓、甘草，药材批号分别编号为S1～S18）均购自华东医药股份有限公司，经浙江省食品药品检验研究院鉴定：半夏为天南星科植物半夏Pinellia ternate（Thunb.） Breit.的干燥块茎；天麻为兰科植物天麻Gastrodia elata Bl.的干燥块茎；白术为菊科植物白术Atractylodes macrocephala Koidz.的干燥根茎；橘红为芸香科植物柚Citrus grandis（L.） Osbeck的未成熟或近成熟的干燥外层果皮；茯苓为多孔菌科真菌茯苓Poria cocos （schw.） Wolf.的干燥菌核；甘草为豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch.的根及根茎。

天麻素对照品（中国药品生物制品检定所，产品编号18011604）；白术内酯Ⅲ对照品（中国药品生物制品检定所，产品编号18041206）；柚皮苷对照品（中国药品生物制品检定所，产品编号17052406）；甘草苷对照品（中国药品生物制品检定所，产品编号16071504）；甘草次酸对照品（中国药品生物制品检定所，产品编号16070701）；异甘草苷对照品（中国药品生物制品检定所，产品编号18042008）；橙皮苷对照品（中国药品生物制品检定所，产品编号15123105）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

Inert Sustain C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；采用梯度洗脱：流动相:乙腈∶水=A∶B，按照乙腈的比例进行梯度洗脱，0～48 min（A%逐渐升高：3%→45%），48～60 min（A%逐渐升高：45%→100%）；流速为1.0 mL/min；进样量：10 μL；检测波长：254 nm；参比波长：400 nm；柱温：30℃。

2.2 样品溶液的制备

2.2.1 半夏白术天麻汤的提取

半夏白术天麻汤按照配方比例混合，加水500 mL，采用武火煮沸和文火慢煎两种煎煮方式进行煎煮，每次煎煮半小时，煎煮完成后，将滤液合并。在旋转蒸发仪中减压浓缩至2.30 g/mL 生药质量浓度。按以上方法制备供试品溶液，每种所选药材为来自不同产地的三种药材，进行正交试验，制备18批半夏白术天麻汤。该提取方法由课题组前期优选所得[7]。

2.2.2 单味药材的提取

按照半夏白术天麻汤处方，分别称取方中6味药材（半夏、白术、天麻、橘红、茯苓、甘草），加水煎煮（武火煮沸、文火慢煎）2次，每次0.5 h，合并滤液。旋转蒸发仪浓缩后定容至10 mL。

2.2.3 供试品溶液的制备

2.2.3.1 半夏白术天麻汤供试品溶液的制备 取“2.2.1”项下的半夏白术天麻汤提取液2 mL，加入甲醇溶液定容至25 mL。密闭后，250 W、40 kHz 超声30 min 使其溶解。静置放冷后再次称定质量，添加甲醇溶液以补充减少的质量。摇匀，用0.45 μm 孔径的微孔滤膜过滤，得到的续滤液即为半夏白术天麻汤供试品溶液。

2.2.3.2 单味药材供试品溶液的制备 取“2.2.2”项下的单味药材提取液2 mL，参照“2.2.3.1”项下溶液制备方法，制备单味药材供试品溶液。

2.2.3.3 阴性对照品溶液的制备 分别精密称取方中药材的6种半夏白术天麻汤组方药，参照“2.2.1”“2.2.3.1”项下溶液制备方法，制得6种阴性对照品溶液。

2.2.3.4 对照品混合溶液的制备 分别精密称取对照 品甘草苷（4.68 mg）、异甘草苷（3.22 mg）、天麻素（5.67 mg）、橙皮苷（2.97 mg）、柚皮苷（3.60 mg）、甘草次酸（2.22 mg）、白术内酯Ⅲ（3.08 mg），放入烧杯，用少量甲醇混合溶解，溶液全部倒入10 mL 容量瓶中，再加甲醇至刻度，摇匀即得对照品混合溶液。

2.3 半夏白术天麻汤HPLC指纹图谱结果

2.3.1 精密度试验

取“2.2.3.1”项下的相同半夏白术天麻汤供试品溶液，连续进样6次，记录指纹图谱，选择响应值相对最高、峰型及保留时间稳定、峰面积较大的柚皮苷峰为参照峰，结果显示，共有峰面积的相对标准偏差（rlative sandard deviation，RSD）全部小于2.90%，相对保留时间的相对标准偏差RSD 全部小于0.80%，说明该方法的精密度良好、可行。

2.3.2 稳定性试验

取“2.2.3.1”项下的相同半夏白术天麻汤供试品溶液，按照“2.1”色谱条件，分别于0、4、8、12、16、24 h进行检测[8]，记录指纹图谱。选择柚皮苷峰作为参照峰，所有共有峰的相对峰面积的RSD 全部小于2.60%，相对保留时间的RSD 全部小于0.98%，表明该供试品溶液在24 h 内是稳定的。

2.3.3 重复性考察

分别取“2.2.1”项下半夏白术天麻汤（编号S1）6份，样品制备参照“2.2.3.1”项下要求进行，按照“2.1”项色谱条件进样进行检测，记录指纹图谱，选择柚皮苷峰为参照峰[9-14]，所有共有峰相对峰面积的RSD 全部小于2.80%，相对保留时间的RSD 全部小于0.88%，表明该方法具有良好的重复性。

2.3.4指纹图谱建立

分别精密取18批“2.2.3.1”项下条件制备的相同半夏白术天麻汤供试品溶液，按照“2.1”项色谱条件进样10 μL 进行测定。采用软件“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012）”，将18批样品的每一个指纹图谱以频道定义（channel definition format，CDF）格式分别依次导入其中，将S18 样品图谱设定为参照图谱，时间窗的宽度为0.10，采用中位数法，进行多点校正色谱峰，自动匹配得系列对照指纹图谱，见图1（封三）。通过标定，得共有峰25个。结果显示，18批供试品溶液色谱图与对照谱相似度均接近1，分别为0.997、0.983、0.994、0.992、0.995、0.986、0.991、0.997、0.996、0.992、0.995、0.994、0.992、0.989、0.993、0.995、0.997、0.998。提示本研究的18批样品之间具有良好的相似度。

2.3.5 共有峰归属分析及鉴定

取“2.2.3.1”项下的相同半夏白术天麻汤供试品溶液（药材批号S1）、“2.2.3.2”项下各个单味药的供试品溶液和“2.2.3.3”项下其相对应的阴性对照供试品溶液，分别精密吸取10 μL，对其进行进样检测，色谱条件按照“2.1”项下所规定的条件，将所有色谱图保存记录，结果见图2（封三）。

对各个共有峰进行归属分析和鉴定，将“2.3.4”项下结果与紫外吸收光谱图和保留时间进行对比。结果显示，在匹配到的25个共有峰中，4、5号峰来自半夏，8号峰来自天麻，6、7、21、22、23、24号峰来自白术，9、12、15、16、17、18号峰来自橘红，10、11号峰来自茯苓，13、14、19、20、25号峰来自甘草，其余无法明确判断来源的共有峰有3个。

参照“2.1”项色谱条件，对混合对照品液进行进样检测，得色谱图及共有峰，其中有7个是特征峰，分别为天麻素（8号峰）、甘草苷（14号峰）、柚皮苷（15号峰）、橙皮苷（16号峰）、异甘草苷（19号峰）、白术内酯Ⅲ（21号峰）、甘草次酸（25号峰）。

图1 18批半夏白术天麻汤方药指纹图谱与对照图谱比对结果

图2 半夏白术天麻汤方药共有峰、特征峰

2.4 定量测定半夏白术天麻汤中的7种成分

2.4.1 专属性试验

将“2.2.3.1”项下半夏白术天麻汤供试品溶液、“2.2.3.4”项下对照品混合溶液、“2.2.3.3”项下阴性对照品溶液（甲醇）各精密吸取10 μL，按照“2.1”项下的色谱条件，对其进行进样分析，结果见图3。

在甘草苷、天麻素、柚皮苷、异甘草苷、橙皮苷、甘草次酸、白术内酯Ⅲ对照品相应位置，存在相同保留时间色谱峰，阴性对照品溶液相应位置未见色谱峰，表明该方法阴性对照品溶液不干扰测定结果。

2.4.2 线性关系考察

图3 专属性试验结果

稀释“2.2.3.4”项下对照品混合溶液，得天麻素质量浓度为0.1745、0.8725、1.7450、3.4900、6.9800 mg/mL；甘草苷质量浓度为0.0041、0.0205、0.0410、0.0820、0.1640 mg/mL；柚皮苷质量浓度为0.0738、0.3692、0.7385、1.4769、2.9538 mg/mL；橙皮苷质量浓度为0.1218、0.6092、1.2185、2.4369、4.8738mg/mL；异甘草苷质量浓度为0.0429、0.2147、0.4293、0.8587、1.7173 mg/mL；白术内酯Ⅲ质量浓度为0.1974、0.9872、1.9744、3.9487、7.8974 mg/mL；甘草次酸质量浓度为0.0085、0.0427、0.0854、0.1708、0.3415 mg/mL，得系列浓度对照品混合溶液。

参照“2.1”项下色谱条件分别进行进样检测，并记录色谱峰面积。横坐标（X）为对照品质量浓度，纵坐标（Y）为峰面积，线性关系结果分别为：天麻素Y1＝0.001X1+0.308，r＝0.9995，线性范围为0.1745～6.9800 mg/mL；甘草苷Y2＝0.041X2+0.114，r＝0.9995，线性范围为0.0041～0.1640 mg/mL；柚皮苷Y3＝0.016X3+0.720，r＝0.9995，线性范围为0.0738～2.9538 mg/mL；橙皮苷Y4＝0.002X4+0.221，r＝0.9995，线性范围为0.1218～4.8738 mg/mL；异甘草苷Y5＝0.015X5+0.288，r＝0.9995，线性范围为0.0429～1.7173 mg/mL；白术内酯ⅢY6＝0.002X6+0.194，r ＝0.9995，线性范围为0.1974～7.8974 mg/mL；甘草次酸Y7＝0.021X7+0.062，r＝0.9999，线性范围为0.0085～0.3415 mg/mL。结果显示，在各个质量浓度范围内，各对照品均具有良好线性关系。

2.4.3 精密度试验

取“2.2.3.1”项下的供试品溶液，按照“2.1”项下色谱条件进样6次，得各成分峰面积。结果显示，天麻素、甘草苷、白术内酯Ⅲ、异甘草苷、柚皮苷、甘草次酸、橙皮苷峰面积的RSD 分别为2.0%、2.1%、1.5%、2.1%、2.4%、2.8%、2.5%，表明该方法精密度较良好。

2.4.4 重复性试验

按照“2.2.3.1”项下的供试品溶液制备方法，平行制备6份供试品溶液，参照“2.1”项下色谱条件进样检测，检测其中7种成分的含量，分别计算其峰面积。结果显示，异甘草苷、甘草苷、橙皮苷、白术内酯Ⅲ、甘草次酸、天麻素、柚皮苷的峰面积RSD 分别为2.8%、2.1%、2.2%、1.9%、2.4%、2.3%、2.0%，表明该方法重复性良好。

2.4.5 稳定性试验

参“2.1”项下色谱条件，分别于0、4、8、12、16、24 h测定“2.2.3.1”项下供试品溶液，计算7种成分的峰面积。结果显示，异甘草苷、天麻素、柚皮苷、甘草苷、白术内酯Ⅲ、橙皮苷、甘草次酸的峰面积RSD 分别为2.6%、1.6%、2.9%、1.3%、2.7%、2.7%、2.8%，表明该供试品溶液24 h 内稳定性良好。

2.4.6 回收率试验

取“2.2.1”项下半夏白术天麻汤溶液（批号S1）6份，精密称定每份12 g，分别加入5 mL的以下7种混合对照品溶液（天麻素0.701 mg/mL、甘草苷0.041 mg/mL、柚皮苷3.170 mg/mL、橙皮苷0.072 mg/mL、异甘草苷0.080 mg/mL、白术内酯Ⅲ0.155 mg/mL、甘草次酸0.005 mg/mL），按照“2.2.3.1”项制备半夏白术天麻汤供试品溶液，参照“2.1”项下色谱条件进行进样检测，得出各成分的平均回收率和RSD值。结果显示，天麻素、甘草苷、柚皮苷、橙皮苷、异甘草苷、白术内酯Ⅲ及甘草次酸的平均回收率分别为98.77%、99.01%、101.94%、102.14%、98.29%、103.47%、97.34%，RSD分别为2.39%、1.95%、2.44%、2.48%、2.50%、2.71%、1.93%，表明该方法的准确度良好。

2.4.7 样品含量测定

精密称取18批半夏白术天麻汤药材，按照“2.2.3.1”项制备供试品溶液，参照“2.1”项下色谱条件进样检测，检测样品中7种成分的含量，测定结果见表1。结果显示，18批样品中各个成分的含量分别是：天麻素2.1933～5.0626 mg/g、甘草苷0.1220～0.2867 mg/g、柚皮苷7.3165～15.8486 mg/g、橙皮苷0.1301～0.3928 mg/g、异甘草苷0.1733～0.4524 mg/g、白术内酯Ⅲ0.2361～0.7849 mg/g、甘草次酸0.0180～0.0372 mg/g。

表1 半夏白术天麻汤中7种成分含量测定结果（mg/g，n=3）

3 讨论

3.1 色谱条件的选择

在190～600 nm 波长下利用二极管阵列检测器全波长扫描，图谱显示，吸收波长254 nm 处，色谱峰形较好、峰数较多、基线平稳，其中7个特征峰响应值均较高，故确定半夏白术天麻汤HPLC指纹图谱的检测波长为254 nm[15-19]。

流动相的选择：初步确定6种流动相，实验结果显示乙腈-（0.05%、0.1%）磷酸、乙腈-0.05%醋酸、乙腈-0.1%甲酸4种流动相检测的峰形响应值过小、峰形不好；甲醇-水出现出峰时间长、拖尾峰过长的情况。故选择乙腈-水作为半夏白术天麻汤指纹图谱的流动相。

3.2 多成分指纹图谱

本实验在收集半夏白术天麻汤处方中6味组成药味各主产地合格饮片的基础上，参照正交设计表L18（37）排列组合，建立多产地来源药材组成的中药复方指纹图谱。研究结果显示，所有测得的样品中的25个共有峰里，有22个已经确定了药材的归属，表明以该方法生成的对照指纹图谱具有一定的代表性。本实验定量测定7个已知成分的含量范围，初步建立半夏白术天麻汤的质量控制体系，能够反映半夏白术天麻汤的质量稳定，为系统研究该方的“物质基准”奠定基础。由于复方中成分多而复杂，本研究工作量有限，只采用了单一的提取制备方法、检测波长及流动相，不能全部分析并考察更多的活性成分。后续会借助高效液相多重质谱仪，如：超高效液相串联四极杆飞行时间二级质谱（UPLC-QTOF-MS/MS）、超高压液相色谱-飞行时间质谱仪（UPLC-TOF/MS）[20]及二维液相等先进现代分析仪器进行深入研究。