猪肌抑素前肽联合乳酸菌对小鼠肌肉发育和免疫性能影响

张应汉，冯旭红，刘文花，郭丽荣，张世强，王璨，曹鹏，秦健，3，杜荣*

（1.山西农业大学 动物医学学院，山西 太谷0030801；2.山西农业大学 生命科学学院，山西 太谷030801；3.山西农业大学 实验教学中心，山西 太谷030801）

肌 肉 生 长 抑 制 素（Myostatin，MSTN）是TGF-β 超家族成员，主要在动物骨骼肌中表达，是脊椎动物骨骼肌发育和生长的重要负调节因子［1］。MSTN基因共编码375 个氨基酸，仅有一个开放阅读框（Open Reading Frame，ORF）。MSTN前体蛋白由N 端信号肽、N 端前肽和C 端的功能区域组成。MSTN前体不具有活性，只有经过2 次的水解之后才能形成具有生物学功能的活性蛋白。第1次水解去除一个由24 个氨基酸形成的信号肽，第2次在N 末端前肽和C 末端成熟肽之间的RSRR（Arg-Ser-Arg-Arg）蛋白酶位点分解，形成前肽和成熟肽，2 个成熟肽结合成为成熟的MSTN活性蛋白［2］，分泌到血液中发挥负调控肌肉生长的作用，而MSTN 前肽则可以与C 端成熟肽形成复合体，抑制其功能的发挥［3］。已有研究表明，MSTN基因突变导致了小鼠和牛骨骼肌的增生和肥大［4］。MSTN基因缺失猪的肌肉量增加了50%～100%［5］。过表达MSTN前肽的基因小鼠其生长性能和肌肉质量显著升高［6］。

本实验室前期研究表明猪MSTN 前肽质粒注射可以促进肌肉的发育，但外源物质注射会引起机体的应激反应和免疫失调，从而影响其促生长效 果［7，8］。因 此 推 测 注 射MSTN 前 肽 的 同时补给促进免疫力的物质可能有助于改进以上问题。鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus，LGG）属于乳杆菌属、鼠李糖乳杆菌种，革兰氏阳性菌，无质粒，不能利用乳糖，可以代谢单糖。近年来，大量研究证明LGG 具有耐酸性、耐消化液，能够在人和动物肠道内定植，具有调节肠道菌群，预防和治疗腹泻、提高机体免疫力等功能［9～11］。研究发现LGG 能够增强轮状病毒引起的IL-12 和TNF-α的产生，诱导机体产生更多的IL-12、TNF-α 和IFN-λ［12］。饲粮中添加LGG 可以改善断奶仔猪的腹泻，并增加肠粘膜sIgA、IL-2 和IL-4 的浓度［13］。LGG 在体外可以增强单核细胞IL-10 和IFN-λ 的分泌［14］。

基于以上背景，本试验选择抗病力和适应力强的昆明小鼠作为模式动物，利用前期构建好的猪MSTN前肽真核表达载体（pcDNA3.1（+）-MSTN pro）注射小鼠股四头肌并（或）灌胃鼠李糖乳杆菌CGMCC1.552，以探究二者联合使用对动物肌肉发育和免疫性能的影响及其机制，为进一步构建可表达MSTN 前肽的基因工程乳酸菌而深入研究并应用于生产实践奠定基础。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与材料

LB 培养基和MRS 培养基，购自索莱宝生物科技有限公司；IFN-λ、IgG、IL-2、TNF-α 测定试剂盒，购自上海酶联生物有限公司；RNA 反转录试剂PrimeScriptTMRT Reagent Kit 和荧光定量试剂SYBR®Premix Ex TaqTMⅡ，购自Takara 公司；引物由北京华大基因生物技术有限责任公司合成；质粒大量提取试剂盒，购自天根生化科技（北京）有限公司。

猪肌肉抑制素前肽（pcDNA3.1（+）-MSTN pro）表达载体和pcDNA3.1（+）空载体为本实验室保存，鼠李糖乳杆菌CGMCC1.552 购自中科院微生物所菌种保藏管理中心。

1.2 主要仪器与设备

KD-T 型电脑生物组织摊烤片机（德国Leica）；YB-6LF 型单冷台（德国Leica）；RM2235 轮转式切片机（德国Leica）；ASP200S-高级智能脱水机自动真空组织脱水机（德国Leica）；MULTISKAN SKY 全波长酶标仪（上海热电科技仪器有限公司）；PCR 仪（美国BioRad）；稳压稳流电泳仪（北京六一仪器厂）；荧光定量PCR 仪（美国Bio-Rad）；光学显微镜（日本OLYMPUS）。

1.3 动物试验分组与处理

将64 只4 周龄健康雄性昆明小鼠，置于室温20～25 ℃，相对湿度为50%～70%的标准动物饲养室，饲喂基础饲粮自由饮水，适应1 周后随机分成A、B、C、D 4 组：生理盐水+空载体（NS+pcDNA3.1（+））组、空载体+乳酸菌（pcDNA3.1（+）+LGG）组、生理盐水+猪肌肉抑制素前肽（NS+ pcDNA3.1（+）-MSTN pro）组、猪肌肉抑制素前肽+乳酸菌（pcDNA3.1（+）-MSTN pro+LGG）组，每组16 只。

第1 天、第16 天对各组小鼠左右后腿股四头肌各分两点注射30 μL 25%蔗糖溶液，0.5 h 后于小鼠左右后腿股四头肌各注射载体60 μL，并且每天早上9：00 灌胃2 mL 生理盐水或者鼠李糖乳杆菌。于15 d 和30 d 每组随机选取8 只小鼠采样。

1.4 质粒的制备

按照质粒大量提取试剂盒说明书提取质粒并调整至浓度为1 g·L-1。

1.5 菌液的制备

将鼠李糖乳杆菌CGMCC1.552 按照3%接种量接种到MRS 液体培养基中，30 ℃培养，活化3代，将活化后的菌液按照3%接种量接种培养18 h，采用平板计数法活菌计数，调整活菌数为5×108CFU·mL-1。4 ℃保存备用。

1.6 指标检测

1.6.1 动物体重测量

每间隔1 d，在早上9：00 给小鼠称重。试验结束，解剖称量小鼠脏器重量，计算小鼠脏器指数。

脾脏指数=脾脏质量/体质量×100%；

胸腺指数=肝脏质量/体质量×100%。

1.6.2 血清免疫指标检测

小鼠眼球采血，将收集的血液在室温下自然凝固15 min，3 000 r·min-1离心20 min，吸取上清液转移至新的离心管。取血清，采用酶联免疫法按照ELISA 试剂盒操作说明书测定IFN-λ、IgG、IL-2 和TNF-α。

1.6.3 小鼠股四头肌肌纤维HE 染色

取小鼠0.25 mm2左右股四头肌置于Bouin′s固定液中，将固定好的组织块依次进行脱水、透明、浸蜡、包埋后按厚度为0.5 μm 进行切片，将切片置于60 ℃烘干机中烘2 h。之后置于二甲苯和梯度酒精脱蜡、苏木精染色、梯度酒精脱水、伊红染色、脱水、透明、中性树脂封片，显微镜下观察并采集图像。用Image-ProPlus 软件对肌纤维的显微镜图片进行处理，利用选色工具选出图片中待测量的肌纤维，用测量工具测量其横截面积并统计分析。

1.6.4 小鼠骨骼肌肌肉生长相关基因检测

根据NCBI 上登录的序列，利用Primer Primier5.0 软件设计引物，引物序列见表1，送华大基因公司进行引物合成。

取小鼠股四头肌，利用Trizol 法提取RNA。采用PrimeScriptTMRT Reagent kit with gDNA Eraser（Perfect RealTime）试剂盒说明书进行反转录。Real-time PCR 体系为10 μL：SYBR Premix Ex Taq Ⅱ（Tli RNaseH Plus）（2×）5 μL，上下游引物0.4 μL，反转录产物1 μL，ddH2O 3.2 μL。反应程序：95 ℃预变性30 s；PCR 反应95 ℃变性5 s，60 ℃退火及延伸30 s，40 个循环。结果根据2－△△CT法计算，GAPDH为内参基因。

1.7 统计学分析

使用SPSS Statistical 21 进行数据分析，采用单因素方差分析和独立样本t 检验，实验数据以平均数±标准差表示，P＜0.05 表示差异显著，P＜0.01 表示差异极显著。

2 结果与分析

2.1 小鼠体质量变化

小鼠体质量变化曲线如图1 所示。由图1 可见，试验期15 d 时，与A 组相比，B 组、C 组、D 组小鼠体质量差异不显著，有升高趋势。试验期30 d时，与A 组相比，C 组、D 组小鼠体质量差异不显著，有升高趋势。

图1 小鼠体质量变化曲线Fig.1 Change curve of mouse body weight

2.2 小鼠胸腺脾脏指数

试验期15 d 时，与A 组相比，B 组、D 组胸腺指数显著升高16.54%、16.41%；与C 相比，D 组胸腺指数显著升高12.13%。与A 组相比，B 组、D 组脾脏指数显著升高24.86%、23.39%；与C 组相比，D 组脾脏指数显著升高17.89%（表2）。

试验期30 d 时，与A 组相比，B 组、D 组胸腺指数显著升高15.53%、14.36%；与C 相比，D 组胸腺指数显著升高17.34%。与A 组相比，B 组、D 组脾脏指数显著升高16.12%、17.22%；与C 组相比，D 组脾脏指数显著升高21.96%（表2）。

2.3 小鼠血清免疫相关因子的含量

试验期15 d 时，与A 组相比，B 组IFN-λ、IgG、IL-2 含量显著升高，分别升高8.62%、13.81%、6.94%，D 组IFN-λ、IgG、IL-2 含量显著升高，分别升高10.44%、10.86%、6.27%。与C 组相比，D组IFN-λ、IgG、IL-2 含 量 显 著 升 高，分 别 升 高7.92%、10.43%、7.28%，TNF-α 含量在各组之间差异不显著（表3）。

试验期30 d 时，与A 组相比，B 组IFN-λ、IgG、IL-2 含量显著升高，分别高22.67%、17.01%、13.83%，D 组IFN-λ、IgG、IL-2 含量显著升高分别升高15.56%、15.70%、12.83%。与C 组相比，D 组IFN-λ、IgG、IL-2 含 量 显 著 升 高 分 别 升 高11.62%、10.22%、12.09%，TNF-α 含量在各组之间差异不显著（表3）。

2.4 小鼠股四头肌肌纤维结构观察

试验期15 d 时，小鼠股四头肌HE 染色如图2所示。由表4 可见，与A 组相比，C 组、D 组的肌纤维横截面积极显著升高，分别升高了19.06%和21.21%。与B 组相比，D 组的肌纤维横截面积极显著升高17.73%。

试验期30 d 时，小鼠骨四头肌HE 染色如图3，肌纤维横截面积分析发现，与A 组相比，C 组、D 组极显著升高15.98%、17.39%。与B 组相比，D 组极显著升高16.08%。

表2 小鼠的胸腺指数和脾脏指数Table 2 Thymus index and spleen index of mice 单位：mg·g-1

表3 小鼠血清免疫因子的测定Table 3 Determination of serum immune factors in mice

图2 小鼠股四头肌HE 染色结果（15 d）Fig.2 HE staining of quadriceps femoris in mice（15 d）

2.5 小鼠股四头肌肌肉相关因子mRNA 的表达

由图4 可见，试验期15 d 时，Real-time PCR 检测肌肉发育相关因子MyoD、MyoG、Myf5、Pax3、Pax7、Myomaker、Smad3和MSTN转录水平的变化，与A 组相比，C 组MyoD、Myf5表达量显著升高100.76%、65.30%，Smad3、MSTN表达量显著降低24.42%、22.93%；D 组MyoD、Myf5表达量显著升高91.80%、71.11%，Smad3、MSTN表达量显著降低22.74%、20.94%。与B 组相比，D 组MyoD、Myf5表达量显著升高83.95%、69.42%，Smad3、MSTN表 达 量 显 著 降 低 22.48%、23.95%。

图3 小鼠股四头肌HE 染色结果（30 d）Fig.3 HE staining of quadriceps femoris in mice（30 d）

由图5 可见，试验期30 d 时，Real-time PCR 检测肌肉发育相关因子MyoD、MyoG、Myf5、Pax3、Pax7、Myomaker、Smad3和MSTN转录水平的变化，与A 组相比，C 组MyoD、Myf5表达量显著升高61.49%、63.64%，MSTN表达量显著降低29.82%；D 组MyoD、Myof5表 达 量 显 著 升 高63.82%、66.97%，MSTN表 达 量 显 著 降 低28.84%。与B 组相比，D 组MyoD、Myof5表达量显著升高59.86%、60.73%，MSTN表达量显著降低31.95%。

图4 肌肉发育相关因子mRNA 表达水平（15 d）Fig.4 mRNA levels of muscle development related factors（15 d）

表4 小鼠肌纤维横截面积Table 4 Cross-sectional area of mouse muscle fiber单位：μm2

3 讨论

MSTN从发现到如今一直是相关领域的研究热点，不少学者致力于通过基因突变或抑制剂使MSTN活性抑制或作用阻断而导致肌肉质量增加［15，16］。肌抑素联合反义寡核苷酸治疗脊髓性肌萎缩症的小鼠，可提高其胫骨前肌35%肌纤维尺寸［17］。本课题组及前人研究表明，猪和鹌鹑等动物前肽的野生型和突变型均能显著抑制肌生成抑制素的作用，其促进肌肉生长的机制主要是由于肌纤维尺寸的增加，而不是肌纤维细胞数量的增加［18～21］。相比于转基因动物研制和注射体外表达纯化的蛋白或多肽，肌肉直接注射质粒DNA 是一种简便、廉价、安全的方法［22，23］。通过质粒DNA 直接注射肌肉进行体内转染，外源基因可在体内表达数月［24］。这些优点使质粒介导的基因传递具有广泛的应用前景。本研究中，我们将前期构建的猪MSTN前肽真核表达载体多点注射于小鼠肌肉，发现注射MSTN前肽的C 组、D 组小鼠股四头肌肌纤维横截面积比对照组显著增加，表明猪肌抑素前肽真核表达载体对小鼠肌肉发育，起到了促进作用。有研究表明注射MSTN前肽基因后max 小鼠体重没有明显差异［25］。本试验发现注射MSTN前肽小鼠体重差距并不明显，仅比对照组表现出升高趋势。这可能与注射次数偏少及注射的异源物种有关，注射MSTN前肽有可能产生一定量的MSTN前肽抗体而削减MSTN前肽的促生长作用，这一结果提示我们采用仔猪进一步试验时应适当增加注射次数，并尽量减少载体上外源性基因片段的干扰。为进一步研究肌抑素前肽真核表达载体促进肌肉生长的机制，我们检测了肌肉 发 育 相 关 基 因MyoD、MyoG、Myf5、Pax3、Pax7、Myomaker、Smad3、MSTN的表达，结果显示，经猪MSTN 前肽真核表达载体处理的试验组小鼠MyoD、Myf5表达量高于对照组，Smad3、MSTN表达量低于对照组。推测当MSTN前肽基因表达后不仅可以阻遏MSTN活性肽的作用，而且能够抑制小鼠自身MSTN基因的表达，而MSTN前肽抑制MSTN表达的原因可能是由于阻断MSTN活性肽作用后反馈性影响了MSTN表达的上游转录调控因子Smad3、MyoD和Myf5等基因的表达。

图5 肌肉发育相关因子mRNA 表达水平（30 d）Fig.5 mRNA levels of muscle development related factors（30 d）

本试验中鼠李糖乳杆菌CGMCC1.552 对小鼠股四头肌的生长发育没有显著影响，但显著提升了小鼠的免疫性能。胸腺和脾脏是机体的主要免疫器官，分别参与机体的细胞和体液免疫。胸腺和脾脏指数能有效反映免疫器官的发育和免疫细胞的功能状况，可以作为衡量机体免疫功能的基本指标之一［26］。有研究发现，乳杆菌活菌可明显增加小鼠脾脏指数，具有提高小鼠机体免疫的功效［27］。本研究中灌胃鼠李糖乳杆菌的B 组、D 组胸腺和脾脏指数比对照组均显著升高，表明鼠李糖乳杆菌CGMCC1.552 能够刺激免疫器官的发育。血清IgG 是体液免疫中最主要的免疫分子，占机体免疫球蛋白总量的70%～80%，在体液免疫中发挥着重要作用［28］。本试验中鼠李糖乳杆菌显著增加了血清IgG 含量，表明其提升了机体的免疫力。免疫细胞及其相关细胞可产生一类具有激素样活性的多肽分子，在免疫应答与免疫调节中发挥重要作用。IL-2 由活化的T 细胞产生，可促进T、B 淋巴细胞和NK 细胞增殖与分化，提高动物机体细胞免疫和体液免疫能力［29］。IFN-λ 由NK 细胞、CD4+T 细 胞 和CD8+T 细胞Th1 亚 群 产生，能够诱导Th1 应答、增加抗原呈递、活化吞噬细胞和NK 细胞以增强杀伤作用［30］。TNF-α 由巨噬细胞和T 细胞产生，它能活化淋巴细胞、激活和转移吞噬细胞以及增加血管通透性。有研究发现，植物乳杆菌C88 联合人参多糖显著上调小鼠血清中IL-2、IL-4、IFN-λ 和TNF-α 水平，下调IL-10 水平［31］。 本 试 验 结 果 表 明，鼠 李 糖 乳 杆 菌CGMCC1.552 显著上调小鼠血清免疫因子IL-2和IFN-λ 的水平，并使TNF-α 的水平有升高趋势，解释了鼠李糖乳杆菌调节免疫或增强免疫能力的部分机制。IL-2 位于细胞因子网络的中心位置，具有广泛的生物活性，有研究表明其可以促进干扰素和肿瘤坏死因子的分泌［29］。这表明本研究乳杆菌对IFN-λ 的升高有可能是直接作用，也有可能是通过IL-2 间接作用，其复杂性的作用和调控关系需要进一步研究。

4 结论

猪肌抑素前肽联合乳酸菌处理起到了了互补效应不仅影响了小鼠肌肉发育相关基因表达水平，促进了肌肉发育；而且上调了小鼠免疫器官指数和血清免疫相关因子水平，提高了免疫性能。鉴于乳杆菌可作为表达功效蛋白或多肽的安全有效的基因工程宿主菌［32，33］。本试验为进一步构建表达猪肌抑素前肽的基因工程乳酸菌以更好地改进猪的健康和生产性能，提供了重要的理论依据。