氮磷添加和栽植密度对大叶相思林土壤微生物群落功能多样性的影响

冯慧芳,林婉奇,薛 立,*

1 华南农业大学林学与风景园林学院, 广州 510642 2 广东省森林资源保育中心, 广州 510173

土壤微生物作为土壤能量和养分循环的“源”和“库”,在维持生态系统功能和服务中起着关键的作用[1]。由于微生物的生成时间短,体积小,对环境变化非常敏感,常被作为评价土壤质量变化的重要指标[2]。因为土壤微生物直接参与了生态系统的物质循环和能量转换,研究其功能多样性对于明确不同环境中微生物群落的作用具有重要意义[3]。土壤微生物群落功能多样性可能受到环境(非生物和生物)因素和人为措施的直接和间接影响[4],其群落组成和功能的变化可能引发一系列反应,如影响养分的转化和循环、凋落物和有机质的分解速率、腐殖质的形成等[5]。BIOLOG分析技术通过微生物对不同碳源的利用特点来直观反映土壤微生物的功能多样性,近二十几年来取得了长足进步而被广泛应用[6]。

由于生产和生活中大量化石燃料的燃烧和化学肥料的过度使用,大气氮(N)沉降增加已成为一个日趋严重的全球化现象[7]。慢性高氮输入会导致许多不利影响,包括增加温室气体排放[8]、养分不平衡[9]以及土壤酸化等[10-11]。在自然状态下,很多亚热带林的土壤都表现为氮丰富及磷(P)限制。在土壤形成过程中,有些树种可以通过生物固氮从而丰富土壤中的氮,而磷随着雨水淋洗和被铁铝固定而不断减少[12],且N沉降可能会导致土壤养分元素不平衡,进一步加剧森林生态系统中的P限制[13]。因此,亚热带森林常常缺P[14]。外源性氮磷的输入会引起土壤微生物群落结构和功能多样性的改变,并对生物地球化学循环和气候―生态系统反馈产生连锁效应[15]。林分密度通过影响光照可以对植物的生长和土壤微环境产生直接或间接影响,如造成树木根系分布、代谢和吸收能力的差异,从而对土壤微生物的代谢和功能多样性产生影响[16]。

目前,国内学者应用 BIOLOG 技术对土壤微生物群落功能多样性开展了较多研究,主要集中在不同施肥方式[17-19]、不同生态系统[20-22]、不同土壤因素和外界环境[23-25]、不同土地利用方式[26-28]条件下土壤微生物功能多样性等方面。近年来林分密度影响土壤特性的研究受到重视。例如,Lie等[29]、冯宜明等[30]、孙千惠等[31]、赵伟文等[32]和王媚臻等[33]分别报道了林分密度对山毛豆(Tephrosiacandida)幼林、云杉(Piceaasperata)幼林、马尾松(Pinusmassoniana)林、华北落叶松(Larixgmelinii)林、油松(Pinustabuliformis)林和柏木(Cupressusfunebris)林土壤养分的影响,林婉奇等[34]研究了氮磷添加与不同栽植密度交互对樟树(Cinnamomumcamphora)盆栽幼苗土壤养分的短期影响,尚未见有关氮磷添加与林分密度交互作用对土壤微生物群落功能多样性影响的报道。

大叶相思(Acaciaauriculiformis)是含羞草科金合欢属速生固N树种,是华南造林绿化、改良土壤、水土保持和滨海防风固沙的主要树种之一。国内外学者对于大叶相思的种子萌发[35-36]、生长[37]、土壤[38-39]、生物量[40-41]和凋落物分解[42]等方面进行过报道,而有关氮磷添加和密度交互作用对大叶相思人工林土壤微生物群落功能多样性的影响尚未见到报道。本研究通过野外模拟实验,以大叶相思人工林为研究对象,采用BIOLOG技术分析氮磷添加和不同林分密度交互对大叶相思林土壤微生物功能多样性的影响,可以为建立合理的林分密度和土壤养分管理提供参考。

1 材料与方法

1.1 研究区概况

试验设在惠州市惠城区小金口(114°17′42″—114°32′16″E,22°56′57″—23°16′03″N),属南亚热带季风气候。年平均气温在19.5—22.1 ℃,年平均降雨量1690—2380 mm,多集中在4—9月份,占年降雨量的80%—85%。夏季多吹东南风,冬季多吹东北风,台风发生在6—10月。土壤为花岗岩发育的赤红壤。

1.2 实验设计

2003年4月在惠州小金口的火烧马尾松林迹地,割除林地上的芒草(Miscanthussinensis)、桃金娘(Rhodomyrtustomentosa)等杂草和藤类后,块状开穴(规格50 cm×50 cm×40 cm),按1667(低密度)、2500(中密度)、4444(较高密度)、10000(高密度)株/hm2栽植苗高约1 m的当年生大叶相思实生苗各2 hm2。2013年4月,在4种密度的大叶相思人工林各建立1个面积为0.4 hm2(50 m×80 m)的样地用于不同施肥方案试验。林分在施肥试验前,没有进行施肥除草等经营活动。在4种密度的样地内分别设5个5 m×5 m的小样方(即5个重复)。每个小样方内设置4种处理(对照(CK)、施N、施P、施N+P),各处理之间设置至少3 m的缓冲带[43-44]。这些地块彼此相距30 m以内,确保了各处理的环境条件,如光、温度、湿度和降水一致。

根据样地的氮沉降水平背景值以及参考同类研究方法[45-46],大气氮沉降中近3/4为铵态氮,故本试验选择氯化铵(NH4Cl)模拟大气氮沉降,并且以二水合磷酸二氢钠(NaH2PO4·2H2O)模拟大气磷沉降。样方内N、P和N+P施肥量分别为NH4Cl 10 g m-2a-1、NaH2PO4·2H2O 5 g m-2a-1、NH4Cl 10 g m-2a-1+ NaH2PO4·2H2O 5 g m-2a-1。2013年4月开始每隔3个月对小样方进行地表喷洒处理,到2015年3月完成试验。具体操作如下：将各处理所需的肥料溶解至1 L 的水,用喷雾器均匀喷洒在土壤表面,CK则喷洒相同体积的水。2013年试验地4种密度林分的基本特征详见表1。

表1 大叶相思人工林基本概况

主要林下植被：玉叶金花Mussaendapubescens、桃金娘Rhodomyrtustomentosa、海金沙Lygodiumjaponicum、芒草Miscanthussinensis、芒萁Dicranopterispedata、梅叶冬青Ilexasprella、了哥王Wikstroemiaindica、米碎花Euryachinensis、野牡丹Melastomacaundidum、黑面神Breyniafruticos；林冠开度采用鱼眼相机拍照,GLA (V2.0)软件计算得出

1.3 土壤样品采集

2015年4月,试验结束时,在各密度林分的5个样方内,用直径2 cm、深10 cm的土钻分别采集CK、N、P和N+P处理的土壤样品约1 kg,取土深度为 0—10 cm。剔除植物残根和大于 2 mm的石子等杂物,装入密封塑料袋,标记挂签,带回实验室用于土壤微生物多样性的测定。

1.4 土壤微生物群落功能多样性的测定

采用Biolog-ECO 微平板法：室温下称取10 g 的新鲜土样放入250 mL的三角瓶中,加入90 mL已灭菌0.85% NaCl溶液,摇床振荡30 min(200 r/min)。将稀释为10-3土壤稀释液经离心去除残留的土壤后,取上清液用于接种。在Biolog-ECO微孔板的每个孔中,接种150μL的悬浮液,碳源利用率是通过减少四唑染料使接种液从无色到紫色来指示。微孔板在25℃下连续培养144 h,期间每隔12 h 用ELISA反应微平板读数器在590 nm处读数,记录吸光值[6]。

1.5 数据处理

Biolog-ECO平板测定的每孔颜色平均变化率(Average well color development,AWCD) 值,用来表示微生物群落利用单一碳源的能力,即微生物的整体代谢活性。我们选择培养后的第96小时的AWCD值分析,因为此时的AWCD值比较稳定。

AWCD的计算方法如下[6]：

AWCD=Σ(Ci-R)/31

式中,Ci为各反应孔在590 nm下的光密度值；R为生态板对照孔(水)的光密度值；Ci-R小于0的孔均在计算中记为0。

碳源利用丰富度指数(S)、Shannon指数(H′)、均匀度指数(E)、Simpson指数(DS)、McIntosh指数(U)是用来表征微生物多样性的常用指标。

土壤多样性指数计算如下：

碳源利用丰富度指数：

S=被利用碳源的总孔目

Shannon指数：H′=-∑PilnPi

均匀度指数:E=H′/lnS；

Simpson指数：DS=1/(Pi)2

式中,Pi=(Ci-R)/∑(Ci-R),表示反应孔与对照孔光密度值之差和整块板总差的比值,ni=Ci-R。

用Excel 2010对土壤数据作图,用SAS 8.2对各处理的土壤微生物多样性采用Duncans法进行多重比较,统计显著水平均为P<0.05。

2 结果与分析

2.1 外源性N和P对森林土壤微生物群落功能多样性的影响

2.1.1土壤微生物培养Biolog-ECO板AWCD值的变化

培养开始后,每隔12 h测定各处理的AWCD值,绘制其随时间变化如图1。在各密度林分中,各处理的AWCD值在培养的48—96 h之间保持快速增加,96 h之后趋于稳定。说明48 h之后碳源被土壤微生物迅速利用。各处理的AWCD 值增长速率各不相同,说明各处理间微生物对碳源的利用能力有较大差异,微生物代谢活性方面有很大差异。各处理AWCD值的顺序为施P>CK>施N+P>施N。在各密度林分中,施P提高了大叶相思林的土壤微生物活性,施N和N+P降低了其土壤微生物活性,且施N的抑制作用大于施N+P。土壤微生物的AWCD值随着林分密度的增加而趋于增加。

图1 大叶相思林土壤的AWCD值Fig.1 Soil AWCD values of the Acacia auriculiformis stands

2.1.2不同处理对土壤微生物群落功能多样性指数的影响

大叶相思各密度林分土壤微生物在Biolog-ECO板中培养96 h时的微生物碳源利用丰富度见图2。施N降低了4个密度林分的土壤微生物的丰富度,施P处理显著提高了4个密度林分的土壤微生物的丰富度(P<0.05),施N+P显著降低了低密度、中密度和高密度林分的土壤微生物的丰富度(P<0.05),对较高密度林分影响不显著。随着种植密度的增大,CK、N+P处理的微生物丰富度指数上升后下降,N处理的丰富度指数呈上升趋势,P处理的丰富度指数先上升后趋于稳定。通常4种处理的低密度林分的微生物丰富度小于其他密度林分。

图2 大叶相思林的土壤微生物丰富度指数S (平均值±标准误差)Fig.2 Soil microbial richness index of the Acacia auriculiformis stands (Mean±SE)不同小写字母表示相同种植密度下的不同氮磷添加处理间差异显著, P<0.05

施N显著降低了较高密度和高密度林分土壤微生物的Shannon指数(P<0.05),对低密度和中密度林分的影响不显著。除了较高密度林分,施P显著提高了其他3个密度林分土壤微生物的Shannon指数(P<0.05),施N+P处理显著提高了低密度林分土壤微生物的Shannon性指数(P<0.05),对其他密度林分的影响不显著(图3)。通常4种处理的中密度和较高密度林分的土壤微生物的Shannon指数大于其他密度林分。

施N、P和N+P对中和较高密度林分的土壤微生物均匀度指数影响不显著。施N显著提高了低和高密度林分的土壤微生物均匀度指数,施P显著降低了低和高密度林分的均匀度指数,而施N+P显著降低了低密度林分和显著提高了高密度林分的土壤微生物均匀度指数(P<0.05)(图4)。

施N和N+P显著降低了4个密度林分的土壤微生物McIntosh指数,而施P处理显著提高了4个密度林分的土壤微生物McIntosh指数(P<0.05)(图5)。通常4种处理的中密度和较高密度林分的土壤微生物的McIntosh指数大于其他密度林分。

施N显著降低了4个密度林分的土壤微生物 Simpson 指数,施P显著提高了4个密度林分的土壤微生物Simpson 指数(P<0.05),施N+P显著提高了低密度林分的土壤微生物Simpson 指数(P<0.05),对其他密度的林分无显著影响(图6)。低密度林分的各处理土壤微生物的Simpson 指数通常小于其他密度林分。

图3 大叶相思林的土壤微生物Shannon-Wiener多样性指数H′(平均值±标准误差)Fig.3 Soil Shannon-Wiener index of the Acacia auriculiformis stands (mean ± SE)不同小写字母表示相同种植密度下的不同氮磷添加处理间差异显著, P<0.05

图4 大叶相思林的土壤微生物均匀指数E (平均值±标准误差)Fig.4 Evenness index of soil microorganisms in the Acacia auriculiformis stands (mean ± SE)不同小写字母表示相同种植密度下的不同氮磷添加处理间差异显著, P<0.05

图5 大叶相思林的土壤微生物McIntosh指数 (平均值±标准误差)Fig.5 McIntosh index of soil microorganisms in the Acacia auriculiformis stands (mean ± SE)不同小写字母表示相同种植密度下的不同氮磷添加处理间差异显著, P<0.05

图6 大叶相思林的土壤微生物辛普森指数(平均值±标准误差)Fig.6 Simpson index of soil microorganisms in the Acacia auriculiformis stands (mean ± SE)不同小写字母表示相同种植密度下的不同氮磷添加处理间差异显著, P<0.05

2.2 氮磷添加与密度对大叶相思林土壤微生物功能多样性的交互作用

由表2可知,氮磷添加和密度处理对大叶相思土壤微生物的AWCD值、碳源利用丰富度、均匀度指数、McIntosh指数、辛普森指数产生显著的交互作用(P<0.05),对香农多样性指数没有显著影响。

表2 氮磷添加和密度对大叶相思林土壤微生物功能多样性的交互作用

3 讨论

3.1 氮磷添加和种植密度对土壤微生物群落碳源利用动力学特征的影响

N是土壤中最常见的限制性营养元素,主要通过氮的固定进入生态系统。增加氮沉降可能会改变土壤微生物群落的组成及其对生态系统结构和功能的反馈[47]。本研究中,各处理土壤AWCD值的大小顺序为施P>CK>施N+P>施N。在各密度林分中,施P提高了大叶相思林的土壤微生物的代谢活性,施N和N+P抑制了其土壤微生物的代谢活性,且施N的抑制作用大于施N+P。这可能是因为大叶相思林土壤缺P限制了其土壤微生物的繁殖和生长,施P通过缓解土壤低磷胁迫从而促进土壤微生物活性。大叶相思有根瘤菌固氮,因而叶片的N含量高。大量的凋落叶归还土壤,导致林地的N含量高。施氮会加剧土壤氮磷不平衡,导致低磷胁迫加剧,进一步降低土壤微生物代谢活性[48]。齐莎等[49]和刘蔚秋等[50]的研究亦发现,施N降低了土壤微生物的AWCD值,改变了土壤微生物的群落结构组成和底物利用模式,抑制土壤微生物的代谢活性和多样性,使得土壤微生物群落结构变得简单化[51]。吴松芹等[21]和隋心等[52]的研究却发现,湿地土壤微生物的AWCD值随着土壤氮含量的增加而逐渐上升,且均高于对照处理。这说明在氮含量较低的土壤中,会产生氮限制,施氮促进了植物的生长,地上较高的生物量会返回土壤,为土壤微生物群落提供充足的碳源,从而促进了微生物的碳代谢活性[53]。

不同密度林分下的光照、林下植被、温度和湿度等环境因子也会影响土壤微生物群落多样性[54]。本研究土壤的AWCD值随着林分密度的增大而增加,这可能与大叶相思林枝叶稀疏有关。低密度林分林内的太阳辐射较强,空气和土壤温度的上升和波动加快,土壤水分因为蒸发速率加快而减少,不适于微生物生长而降低微生物的功能多样性[55]。大叶相思有根瘤菌固氮,叶片的养分含量高。随着林分密度的提高,林分凋落物量增加,土壤养分含量提高,促使了单位面积的根系密集度高且覆盖土壤范围大,而根系分泌物中的糖类和氨基酸及维生素等可以为植物根际微生物提供充足的养分,从而增加了根际微生物数量和活性[56]。

3.2 外源性氮磷和种植密度对土壤微生物功能多样性指数的影响

碳源利用丰富度指数(S)、Shannon指数(H′)、均匀度指数(E)、Simpson指数(DS)、McIntosh指数(U)是用来表征微生物多样性的常用指标。本研究中,连续2年施N和施N+P显著降低了4个密度大叶相思林分的土壤微生物碳源利用丰富度指数、McIntosh指数、Shannon指数、Simpson指数,可能与大叶相思林地的土壤N含量高有关。袁颖红等[17]连续6年模拟氮沉降对杉木人工林土壤微生物功能多样性影响的研究发现,低氮处理有利于提高微生物群落的Shannon指数与McIntosh指数, 高氮处理则表现出抑制作用。说明施肥时间和施肥量对土壤微生物多样性指数具有重要影响,氮沉降适量时能提高土壤微生物的多样性指数,而长期高氮沉降则会抑制土壤微生物的多样性[57]。Sarathchandra等[58]的研究却发现,N添加下后新西兰汉密尔顿草原土壤微生物的Shannon指数高于CK 处理。这可能是因为施肥条件和土壤肥力不同,导致土壤养分指标发生变化,进而影响土壤微生物的功能多样性。

本研究中,施P显著提高了大叶相思4个密度林分的土壤微生物碳源利用丰富度指数、Shannon指数、McIntosh指数、Simpson指数。由于大叶相思试验林位于亚热带红壤,林地普遍缺磷[14],施P肥能够快速有效地补充土壤中速效磷的含量,有利于大叶相思人工林生产力的恢复和提高。施P还能通过改变土壤的理化性质,影响地上植被的生长能力、竞争能力和存活能力,进而间接影响土壤微生物的功能多样性[59]。字洪标等[22]的研究发现,川西北高寒草甸土壤0—10 cm土层微生物的McIntosh 指数和Shannon指数随着P肥的增加而显著降低。这可能与试验地的气候、生态系统类型和和土壤特性有关。青藏高原海拔高,树木受生长季低温限制,土壤的磷矿化作用较低,速效P含量低,在P限制的条件下,过量施P反而会抑制土壤微生物的代谢活性[60]。

本研究中,低密度林分的土壤微生物的碳源利用丰富度指数、Shannon-Wiener指数、McIntosh指数和 Simpson指数通常小于其他密度林分。这可能是因为低林分密度下,林下植被获取光照和养分等资源多,灌木草本层的快速生长会吸收土壤的养分元素,同时阻碍凋落物落到地面,延缓其分解,导致土壤的肥力下降,从而影响了土壤微生物的代谢和功能活性[61]。在中密度和较高密度林分中,各处理的均匀度指数没有显著差异。这可能是因为施肥导致土壤中原本数量庞大的微生物类群减少,同时可能促进新的微生物类群产生,从而保持土壤微生物的微生物的均匀度指数相对稳定[62]。

3.3 氮磷添加与密度对大叶相思微生物功能多样性的交互作用

氮磷添加、密度及氮磷添加和密度的交互作用均对大叶相思林土壤的AWCD值、碳源利用丰富度指数、均匀度指数、McIntosh指数和 Simpson指数产生显著的作用。氮添加对大叶相思林土壤微生物多样性指数具有显著负效应,磷添加对土壤微生物多样性指数具有显著的正效应。在一定林分密度范围内,密度对微生物多样性指数具有显著正效应,但是通常氮添加的负效应大于密度处理的正效应。大叶相思林土壤富含氮而缺磷,氮磷添加缓解了P限制,从而提高土壤微生物的代谢活性,而过量的氮添加产生土壤酸化以及铝毒效应,反而抑制了土壤微生物群落的代谢活性。一定林分密度范围内,土壤单位面积的根系密集,根系分泌糖类、氨基酸和维生素等养分多,养分的增加刺激了土壤微生物多样性。由上可见,N添加和密度的交互作用引起土壤微生物多样性的下降,P添加和密度的交互作用引起土壤微生物多样性的上升。

全球性的大气氮沉降日趋严重,影响了土壤微生物的分解能力,进而导致土壤养分有效性的变化。林分密度是人工林群落的重要结构特征,合理的林分密度可以提高人工林的生产力,改善生态系统的服务功能和健康状况。加强氮磷添加和密度处理对土壤微生物功能多样性的交互作用的研究,合理设置土壤微生物多样性施肥水平和林分密度,有助于弄清土壤微生物多样性对全球变化的响应机制。目前,仅利用 BIOLOG 技术从碳源代谢的角度来探讨微生物功能多样性还存在一些局限性,今后还需借助于高通量测序、PLFA等技术,同时结合合理的统计分析方法,从不同层面对土壤微生物功能多样性开展研究[63]。