野生灵芝的分离鉴定及林下栽培技术研究

吴国华，付雅丽，叶茂平，童小青，饶雨欣，江宏，王勇军,3

（1.浙江省龙泉市林业局，浙江 龙泉 323700；2.浙江农林大学 林业与生物技术学院，浙江 杭州 311300；3.浙江农林大学，省部共建亚热带森林培育国家重点实验室，浙江 杭州 311300）

灵芝Ganoderma lucidum隶属于担子菌纲Basidiomycetes多孔菌目Polyporals多孔菌科Polyporaceae灵芝属Ganoderma，被誉为百草之王，是中国名贵传统中药材，在我国已有2 000多年的药用历史，具有滋补强壮、扶正固本的功效[1]。灵芝及其孢子粉中含有多糖类、三萜类、蛋白质、甾醇类、核苷类、微量元素等生物活性成分[2]。现代临床医学研究证明，灵芝具有调节免疫、抗肿瘤、保肝解毒、抗衰老、抗神经衰弱、降血糖等功效[3-5]。我国在20世纪50年代首次成功栽培灵芝并逐渐实现了灵芝规模化生产，现已成为灵芝重要栽培和加工的国家[6]。据2015年数据统计，我国灵芝及孢子粉年产量约12万t，产值达到16亿美元[6]。浙江灵芝商品性生产始于20世纪70年代，已成为全国灵芝及孢子粉的主产区，主要集中在龙泉、庆元、莲都、武义等生态环境优越的山区，其中龙泉灵芝孢子粉2011年被列为国家地理标志产品保护[7]。

目前，我国灵芝栽培主要以袋料栽培和段木基质栽培为主[6]。随着灵芝需求量的提高，栽培场地的不断扩大，新型栽培模式也在不断探索。林下仿野生栽培，将菌丝袋料或段木覆土于遮阳较好的树林下培育出芝，可有效克服栽培场地短缺、连作障碍等问题[8]，并具有产量高、生物转化率高等优点，已在四川、福建等山区林地得到推广和应用[9-10]。龙泉灵芝目前主要以大田栽培为主，主要栽培品种为‘沪农灵芝1号’，针对林下栽培尚无可大面积推广的品种[11]。本研究从龙泉市森林中采集野生灵芝子实体并分离菌种，筛选生长性能优良的菌种并完成野生灵芝的鉴定，建立了野生菌株的林下栽培技术，旨在为龙泉灵芝提供新的菌种资源和林下栽培模式。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 菌种采集 2017年8月，在浙江省龙泉市兰巨乡梅地村天然林（地理坐标为119°7'41.22" E，27°56'56.43"N，海拔650～700 m）中进行野生灵芝采集，用小刀切取新鲜灵芝，连同菌柄和菌盖，装入取样袋中，置于冰盒保存，记录灵芝着生的宿主植物种类。从不同地点采集得到8个野生灵芝样品，带回实验室进行分离及纯化。龙泉市属亚热带季风气候区，年平均温度为17.6℃，年平均降水量为1 664 mm，平均空气相对湿度为79%，平均日照为1 823.8 h，无霜期为262 d。

1.1.2 培养基 马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂20 g，水1 000 mL，pH 7.0，121℃下高温灭菌20 min。木屑麦麸培养基（原种培养基）：木屑750 g，麦麸240 g，石膏10 g，水1 200 mL，pH 6.5，采用100℃下常压灭菌24 h。段木栽培基质：将供试的直径为5～8 cm的板栗Castanea mollissima、枫香树Liquidambar formosana、青冈Cyclobalanopsis glauca或麻栎Quercus acutissima的多年生枝条锯成30 cm长的段木，分别装入高密度低压聚乙烯筒袋内，每袋装入7根相同段木，采用100℃下常压灭菌24 h。

1.1.3 栽培场地 栽培场地设置在浙江省龙泉市兰巨乡梅地村附近的次生林中，地理坐标为119°7'41.20" E 27°56'56.43" N，海拔500～700 m，坡度在25°～30°，林地以阔叶树种为主，主要包括枫香树、青冈等，土质疏松，偏酸性沙质土，经间伐后林分郁闭度分别为0.4、0.6和0.8。

1.2 试验方法

1.2.1 灵芝菌丝分离纯化 将采集到的灵芝样品用75%酒精表面消毒10 s后，用无菌水冲洗2遍，用无菌剪刀在灵芝菌盖嫩边圈剪取长、宽均为1 mm大小的边缘菌块，将菌块接种于PDA培养皿中，避光条件下28℃培养。待长出菌丝，用挑针挑取少量菌丝置于新鲜PDA培养皿中，进行培养，观察菌丝形态，获得纯培养物。按菌种生长速度，选出菌丝生长最快的灵芝菌种作为研究菌种。

1.2.2 扫描电镜观察 选出生长最快的菌种作为研究菌种，取该灵芝孢子粉用无菌水重悬后，加入2.5%戊二醛于4℃下浸泡过夜，加入磷酸缓冲液（pH 7.0）浸泡15 min，浸洗3次，再用1%锇酸溶液固定样品1～2 h，再用磷酸缓冲液（pH 7.0）漂洗15 min，随后依次将样品浸泡于30%、50%、70%、80%、90%和95%的乙醇溶液中，每次浸泡15 min。移除乙醇溶液，用100%乙醇洗脱20 min，洗脱2次，然后用乙醇与乙酸异戊酯溶液（1/1，V/V）浸没30 min后，用100%乙酸异戊酯浸没样品2 h，晾干备用。将样品在临界点进行镀金，放置于扫描电子显微镜（Phenom ProPW-100-011，荷兰）下进行观察。

1.2.3 ITS-PCR及测序 采用Ezup柱式真菌基因组DNA抽提试剂盒（生工®，上海）提取灵芝菌丝的总DNA，采用真菌核糖体基因间隔区（ITS）通用引物 ITS1（5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’）和 ITS4（5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’）对基因组DNA进行PCR扩增[12]。扩增反应为：94℃/5 min；94℃/45 s，55℃/45 s，72℃/1 min，共30个循环；72℃/8 min。将扩增得到的PCR产物送生工生物工程(上海)股份有限公司双向测序，采用DNAMAN软件进行拼接。序列采用MEGA 7.0软件进行系统发育树构建，采用Maximum likelihood analysis进行分析，自展数据（bootstrap）为1 000次[13]。

1.2.4 灵芝菌包的制备 将在PDA上生长的灵芝菌丝，接入原种培养基中，在黑暗条件下18～22℃进行发菌；待白色菌丝长满原种培养基菌袋后，在无菌条件下用镊子取含有菌丝的培养料，加入供试的4种段木栽培基质的两端，扎口后，置于黑暗条件下22～24℃进行发菌；20～30 d后，待菌丝长满段木表面1周后，取出移至林地进行栽培。

1.2.5 灵芝林下栽培管理及采收 根据林区山坡的特征，设计灵芝菌包的排放位置，并进行起垄，每排灵芝菌包间隔25 cm，每垄安排4排菌包。在2018年4－5月选择晴天排放菌包，通风15～20 d后脱去菌袋，覆盖厚度1～2 cm泥土，再在泥土上盖一层树叶；出芝后，保持湿润通气，当大部分灵芝菌盖表面色泽一致，边缘无嫩边圈时，即行采收。采用套筒采集法进行孢子粉采收，将灵芝菌盖和接粉薄膜上的孢子粉刷下，将收集到的孢子粉放置在干净容器里。

1.2.6 不同段木对灵芝林下栽培影响的小区设计 将用板栗、枫香树、青冈和麻栎4种不同段木栽培基质制备的灵芝菌包进行标记，于2018年4月，随机摆放在垄上，每垄摆放不同段木制备的灵芝菌包各20个，共3垄。约70天后，待灵芝孢子不再大量产生，进行孢子粉采收。取试验区每个灵芝，进行菌柄长度、菌盖直径、生物转化率、子实体干质量、孢子粉质量等指标进行测定。生物转化率（%）为子实体干质量和孢子粉质量之和占接种前段木质量的百分比。粉芝比（%）为灵芝孢子粉质量与子实体干质量的比例。

1.2.7 林间不同郁闭度对灵芝林下栽培影响的小区设计 适当间伐，采用树冠投影法确定林分郁闭度，得到郁闭度分别0.4、0.6和0.8的林下栽培区。栽培区树种主要为青冈和枫香树，树龄约为20年，树高6～8 m。于2018年4月，将菌包排放在不同郁闭度的林区，每个郁闭度的林区设置3垄，每垄放置20个菌包。待灵芝孢子不再大量产生，进行孢子粉采收。取试验区每个灵芝，进行菌柄长度、菌盖直径、生物转化率、子实体干质量、孢子粉质量等指标进行测定。

1.2.8 设置灵芝棚对灵芝林下栽培影响的小区设计 于2019年4月，根据上年段木筛选试验结果和郁闭度试验结果，在麻栎段木栽培和林分郁闭度为0.8的栽培条件下，进行灵芝棚对灵芝生长及孢子产量的比较试验。处理组采用在灵芝菌包林下摆放并覆土后，用塑料膜支起50 cm高的灵芝棚盖住整垄，待到灵芝菌盖嫩边圈消失后，撤下灵芝棚，空白组不设置灵芝棚，每个处理设置3垄，每垄放置20个菌包。待灵芝孢子不再大量产生，进行孢子粉采收。取试验区每个灵芝，进行菌柄长度、菌盖直径、生物转化率、子实体干质量、孢子粉质量等指标测定。

1.2.9 统计分析 所有数据采用SPSS 19软件进行统计分析，采用Duncan新复极差法进行多重比较，采用t检验对两组数据进行比较。

2 结果与分析

2.1 不同灵芝菌种的生长速度测定

将采集到的8个野生灵芝样品进行培养，得到纯菌丝体，分别命名为LQ01、LQ02、LQ03、LQ04、LQ05、LQ06、LQ07、LQ08菌种。将这8个菌种分别在PDA和原种培养基上进行接种，测定菌丝的生长速度，结果如表1。由表1可知，从板栗上分离的菌种LQ06在PDA和原种培养基上的生长速度均显著高于其他菌种（P＜0.05），在PDA上第5天就长满整个培养皿，接种原种培养基后，第14天菌丝平均直径达到16.12 cm，表现出优良的生长性状。因此，本研究选择菌种生长最快的LQ06作为其他试验的菌种。

表1 不同菌种在PDA和原种培养基上的生长Table 1 Growth of isolated 8 strains on PDA and primary stock substrate

2.2 灵芝菌种LQ06的生长特性及ITS序列分析

LQ06菌丝体在PDA培养基上呈现浓密白色，较纤细，粗细均匀，菌丝透明（图1A）。担孢子呈椭圆形，表面有网纹孔格，大小为（5.3～6.4）μm×（2.7～3.8）μm（图1B）。PCR扩增获得菌株LQ06的ITS部分序列，NCBI登录号为MT936513。利用MEGA 7.0软件构建的系统发育树分析结果显示，LQ06与灵芝G.lucidumDai2272菌株和G1T099菌株亲缘关系最近，与G.lucidumDai2272的相似度为97.09%，构成一个分支（图2）。菌丝和担孢子形态以及ITS序列比对结果进一步明确了菌株LQ06为灵芝属灵芝种G.lucidum真菌。

图1 灵芝LQ06菌丝（A）和担孢子（B）形态Figure 1 The mycelium of G.lucidum LQ06 growing on PDA (A)and morphology of basidiospores

图2 基于ITS序列构建的系统发育树Figure 2 Phylogenetic tree inferred from the Maximum likelihood analysis based on the ITS dataset

2.3 林下栽培过程中灵芝LQ06的生长特征

将得到的灵芝菌种LQ06经试管母种生长和原种扩繁后，接种于消毒后的麻栎段木栽培基质上，进行发菌处理，待到菌丝布满菌棒后，于2020年5月移至林地（图3A）。30 d后，进入出芝期（图3B），随后菌盖不断展开，菌柄伸长，约45 d后，菌盖嫩边圈开始消失，菌盖颜色呈现赤色，50 d后，菌盖嫩边圈完全消失，担孢子开始从菌盖下表面的多孔中开始产生（图3C）。

2.4 不同段木栽培基质对林下栽培灵芝LQ06的生长性状及孢子产量的影响

选择枫香树、板栗、青冈、麻栎4种段木栽培基质进行灵芝LQ06的栽培，结果如表2。

表2 不同段木栽培基质对林下栽培灵芝生长性状和孢子产量的影响Table 2 Effect of different cut logs on growth traits and spores yield of G.lucidum LQ06 cultivation under forest

由表2可知，以麻栎作为段木栽培基质的灵芝生长最快，在灵芝孢子粉不再大量产生时，菌柄平均长度达到9.57 cm，菌盖平均直径达到19.61 cm，生物转化率为6.14%，每个成熟灵芝子实体平均干质量为112.56 g，孢子粉平均质量为108.54 g，粉芝产量比为96.43%。以青冈、板栗、枫香树为段木栽培基质的灵芝生长和孢子粉质量均显著低于麻栎（P＜ 0.05）。

2.5 不同郁闭度对林下栽培灵芝LQ06的生长性状及孢子产量的影响

以麻栎段木为栽培基质，选择不同郁闭度的林地进行灵芝菌种LQ06的栽培，结果如表3。由表3看出，在郁闭度为0.6和0.8的林地栽培的灵芝生长较好，其菌柄长度、菌盖直径、生物转化率、单个子实体干质量以及孢子粉质量，均显著高于郁闭度为0.4的林地（P＜ 0.05）。郁闭度为0.6和0.8的林区栽培的灵芝之间无明显差异。

图3 灵芝林下栽培现场（A）及子实体生长发育过程（B和C）Figure 3 The cultivation of G.lucidum LQ06 under forest (A)and development of fruiting body (B and C)

表3 不同郁闭度对林下栽培灵芝的生长性状和孢子产量的影响Table 3 Effect of different crown density on growth traits and spores yield of G.lucidum LQ06 cultivation under forest

2.6 灵芝棚搭建对林下栽培灵芝LQ06的生长性状及孢子产量的影响

在以麻栎段木为栽培基质和郁闭度为0.8的栽培条件下，搭建灵芝棚，测定搭建灵芝棚对灵芝生长性状和孢子产量的影响，结果表4。由表4可以看出，搭棚组灵芝的菌柄平均长度为12.04 cm，显著高于无棚对照组（8.72 cm），两处理的菌盖直径无显著差异，有棚组的生物转化率为5.63%，显著高于对照组（P＜ 0.05）；有棚组的单个灵芝子实体干质量为163.43 g，孢子粉平均质量为152.37 g，均显著高于对照组（P＜ 0.05）。

表4 灵芝棚搭建对林下栽培灵芝的生长性状和孢子产量的影响Table 4 Effect of greenhouse on growth and spores yield of G.lucidum LQ06 cultivation under forest

3 结论与讨论

3.1 讨论

优良的菌种资源是灵芝育种和栽培的重要前提[14-15]。当前，灵芝菌种的鉴定主要以担孢子形态、子实体形态以及真菌ITS序列为参考指标[16]。LQ06的担孢子呈椭圆形，表面有网纹孔格，其形态特征及大小与G.lucidumDai2272相似[12]，子实体为典型赤色，ITS序列分析结果发现LQ06与来源于中国的G.lucidumDai2272[12]和意大利的G.lucidumG1T099[17]亲缘关系最近，与G.lucidumDai2272[12]的相似度为97.09%，基于此确认其为G.lucidumDai2272，这为龙泉林下栽培提供了新的菌种资源。

灵芝林下栽培与其他栽培环境相比，存在着自然环境不可控制、生长速度较为缓慢等问题。灵芝在不同基质营养、光照、温度等不同环境下，生长和发育均会表现出差异[10,18-19]。本研究针对灵芝LQ06菌种林下栽培中的段木基质、林区郁闭度以及搭建灵芝棚等因素对灵芝生长和孢子粉产量的影响进行了分析。初步明确了灵芝LQ06林下栽培过程中，以麻栎作为段木基质、林间郁闭度在0.6～0.8为宜。同时，参照龙泉灵芝大田栽培技术[11]，覆土后搭建灵芝棚，可保证出芝期灵芝幼嫩组织能快速健康生长，有效促进灵芝的生长和提高孢子粉产量。

本研究中灵芝菌种LQ06在浙江龙泉的林下栽培得到的每颗灵芝孢子粉平均产量为152.37 g，虽不及‘沪农灵芝一号’在大田栽培的产量（每颗灵芝产孢子粉178.5 g）[20]，但在耕地少的山区开展林下栽培具有推广意义。不同栽培条件下灵芝孢子粉中药效成分可能存在差异，后续将进一步研究该菌种孢子粉破壁后有效成分含量及药理。

3.2 结论

本研究从浙江龙泉森林中获得了一个具有生长优势的野生灵芝菌株，通过形态学和ITS序列分析，进一步明确了该菌株为灵芝属灵芝种真菌G.lucidumDai2272，建立了该菌株麻栎段木栽培、林分郁闭度0.6～0.8之间、早期搭建灵芝棚等林下栽培技术，达到了单颗灵芝产孢子粉质量超过150 g的栽培效果，为灵芝林下栽培及龙泉林下经济发展提供了新的菌种资源和技术支持。