乳腺癌组织中miR-155、HER-3 的表达及临床意义

纪晓楠 李 勇 李恩杰

辽宁省本溪市中心医院普外科，辽宁本溪 117000

乳腺癌是最常见的危害女性健康的恶性肿瘤之一，其发病率占人类所有恶性肿瘤发病率的7%～10%，并且其发病率呈逐年上升趋势[1]。乳腺癌早期临床症状不典型，因此，部分患者发现时已是晚期，并伴随淋巴结转移，情况不容乐观。微小RNA（miRNA）是一种内源性单链非编码RNA，长度为19～24 个核苷酸[2]。miRNA 可以与靶基因的3’UTR 区以不完全互补的方式结合，发挥其生物学作用，如抑制蛋白质翻译等[3]。研究发现[4]，miRNA-155（miR-155）在多种肿瘤细胞中均呈高表达状态，如胃癌、结肠癌等，并且其参与癌细胞的发生发展。潘虹等[3]认为，miR-155 可能在乳腺癌细胞的增殖、分化过程中发挥了重要作用。人类表皮生长因子受体（HER）家族，包括HER-1、HER-2、HER-3 和HER-4。目前，HER-2 已经成为乳腺癌治疗的靶点[5]。HER-3 也具有多重生物学功能，如参与细胞增殖及分化过程。有研究显示[6]，HER-3可以促进某些肿瘤生长，进一步加重肿瘤的恶性程度，如肺癌、胃癌。miR-155 与HER-3 在乳腺癌细胞中均呈高表达，但两者在乳腺癌中的具体作用机制还不明确。本研究通过检测miR-155 与HER-3 在乳腺癌中的表达并分析与临床资料之间的关系，探究两者在乳腺癌发生发展过程中的作用及意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2016 年3 月—2019 年8 月辽宁省本溪市中心医院（以下简称“我院”）收治的乳腺癌患者87 例为研究对象。纳入标准：①经活检病理或术中病理检查确诊为乳腺癌；②首次诊断乳腺癌，且从未接受过任何抗肿瘤治疗；③临床病理治疗完整，且签署知情同意书。排除标准：①患有其他系统恶性肿瘤，如肺癌、胃癌等；②患有免疫功能缺陷。患者均为女性；年龄36～66 岁，平均（50.4±3.72）岁；≥50 岁53 例，＜50 岁34 例；肿瘤分化程度：中低分化49 例，高分化38 例；TNM 分期：Ⅰ期30 例，Ⅱ期23 例，Ⅲ期23 例，Ⅳ期11 例；有淋巴结转移31 例，无淋巴结转移56 例；肿瘤直径＜2 cm 32 例，≥2 cm 55 例；月经初潮年龄＜13 岁42 例，≥13 岁45 例。本研究经我院医学伦理委员会批准。

1.2 方法

1.2.1 实时荧光定量PCR 技术（qRT-PCR）检测miR-155 的表达 收集活检或术中获取的乳腺癌组织及癌旁组织（距离肿瘤边缘＞5 cm），冷冻保存并立即送检。取100 mg 组织标本，应用Trizol 法提取总RNA（试剂盒购自美国Thermo 公司，生产批号：20160217），使用紫外分光光度仪检测RNA 浓度，符合标准的RNA冻存备用。使用RNA 逆转录试剂盒（德国QIAGEN 公司，生产批号：20160211）将提取出的RNA 反转录为cDNA，U6 作内部参考。反应条件为37℃60 min，95℃5 min。反应体系为：0.15 μL dNTP，1 μL 逆转录酶，1.5 μL 10×RT 缓冲液，0.188 μL RNase 抑制剂，1 μL RNA，3μL miR-155/U6 RT 引物和8.162 μL NFH2O。qPCR 反应条件为：94℃预变性5 min，再变性1 min，60℃45 s，72℃延伸40 个循环，最后72℃再延伸10 min。反应体系为：10 μL 2×SYBR Green，1 μL 20×TaqDNA聚合酶，1.33 μL miR-155/U6 RT 产物和7.67 μL H2O。引物序列：miR-155，F：5’-AACTTGTAAACTCCCTCGACTG-3’，R：5’-CCTTACGTGACCTGGAGTCG-3’；U6，F：5’-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3’，R：5’-CGCTTCAGAATTTGCGTGTCAT-3’；GAPDH，F：5’ -CGCTCTCTGCTCCTCCTGTTC -3’，R：5’ -ATC CG-TTGACTCCGACCTTCAC-3’。每个样本至少重复3 次，最后采集荧光信号，结果以2-ΔΔCt来计算和标准化miR-155 的相对表达量。

1.2.2 免疫组化检测HER-3 蛋白的表达情况 将获取的乳腺癌及癌旁组织甲醛固定并经石蜡包埋后，使用切片机切成厚度为5 μm 的切片，依次经过二甲苯脱蜡、无水乙醇梯度水化及PBS 清洗。再将切片浸泡在枸橼酸缓冲液中，100℃加热10 min 室温冷却，PBS 清洗。使用3% H2O2室温孵育切片10 min，滴加一抗（美国ABCam 公司，生产批号：20160112），室温孵育1 h，清洗后滴加二抗（北京ZSGB-BIO 公司，生产批号：20160202），室温孵育0.5 h，DAB 显色5 min，苏木精复染3 min，乙醇再次梯度水化，最后树脂封片。由专业病理医师显微镜镜检（200×），选取20 个视野，计算每个视野的阳性细胞百分数，0～5%记0 分，＞5%～25%记1 分，＞25%～50%记2 分，＞50%～100%记3 分；按细胞染色强度，未着色0 分，浅黄色1 分，棕黄色2 分，黄褐色3 分。将以上两项得分结果相乘[6]，0～2 分为阴性，3～5 分为+，6～8 分为++，9 分为+++。

1.3 统计学方法

采用SPSS 22.0 统计学软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（）表示，两组间比较采用t 检验；计数资料用例数或百分率表示，组间比较采用χ2检验；相关性采用Spearman 相关分析。以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 乳腺癌组织与癌旁组织中miR-155 与HER-3 的表达情况

乳腺癌组织中miR-155 的相对表达量分别为（0.452±0.083），高于癌旁组织的（0.125±0.026），差异有高度统计学意义（t=35.067，P ＜0.001），见图1。乳腺癌组织中HER-3 的阳性表达率为70.11%（61/87），高于癌旁组织的31.03%（27/87），差异有高度统计学意义（χ2=26.578，P ＜0.001），细胞染色结果见图2（封四）。

图1 乳腺癌组织及癌旁组织miR-155 电泳图

2.2 乳腺癌组织中miR-155 和HER-3 的表达与患者临床资料之间的关系

不同肿瘤细胞分化程度、TNM 分期及有无淋巴结转移的乳腺癌组织中miR-155、HER-3 表达比较，差异有统计学意义（P ＜0.05）。见表1。

2.3 乳腺癌组织miR-155 与HER-3 的表达相关性分析

Spearman 相关分析结果显示，miR-155 与HER-3的表达呈正相关（r=0.576，P ＜0.05）。

3 讨论

乳腺癌是引起女性死亡的第二大恶性肿瘤[7]。近年来，随着医疗水平进步飞快，部分乳腺癌患者可以实现早诊断、早治疗，提高了患者的生存率。但是，现有的乳腺癌生物标志物的诊断性能仍然存在缺陷，比如癌胚抗原，虽然广泛应用于乳腺癌的监测，但其敏感性较低[8]。因此，积极寻找有效的乳腺癌生物学指标对于乳腺癌的诊断及治疗有着重要的意义。

表1 乳腺癌组织中miR-155 与HER-3 的表达与患者临床资料之间的关系

miRNA 是一种短链且单链的RNA，是各种细胞增殖分化过程中的重要的调节因子[9]。有研究显示[10]，某些miRNA 可以调节细胞增殖和凋亡过程，可能会促进癌症的恶性程度。miR-155 是一种致癌基因，在多种肿瘤细胞中均有表达。Liu 等[11]认为，乳腺癌中miR-155 的表达水平是正常乳腺组织中的5 倍。这与本研究结果有相同之处。本研究结果显示，乳腺癌组织中miR-155 的表达水平高于癌旁组织（P ＜0.05）。其原因可能为miR-155 上调其靶基因HDAC2 的表达，而后者可以抑制酪氨酸激酶受体2（ErbB2）转录，ErbB2 可以抑制癌细胞的生长，miR-155 的高表达使机体实现代偿性地抑制肿瘤细胞增殖和恶性进展的作用[12]。本研究结果显示，不同肿瘤细胞分化程度、TNM 分期及有无淋巴结转移的乳腺癌组织中miR-155 表达比较，差异有统计学意义（P ＜0.05）。JAKSTAT 是最重要的信号传导途径之一，而miR-155 可以下调SOCS1 表达并激活JAK-STAT 信号通路，使其与某些与肿瘤相关的炎症因子如白细胞介素-6、脂多糖等表达增加，促进了肿瘤细胞的增殖和分化过程[13]。基质金属蛋白酶（MMP）16 属于MMP 家族，是调节肿瘤迁移和侵袭的重要细胞因子。有研究发现[14]，MMP16 除了参与正常的生理过程外，还参与肿瘤的发生发展，例如胚胎发育和组织重塑。miR-155通过上调MMP16 的表达，促进乳腺癌细胞的迁移及转移过程。FOX3a 是miR-155 的靶基因，FOX3a 可以诱导细胞凋亡过程，当miR-155 抑制FOX3a 的表达时，间接抑制了肿瘤细胞凋亡的过程，使得肿瘤恶性程度增高，TNM 分期升高[15]。

HER-3 是HER 家族的一员，其染色体位置为12q13。HER-3 由跨膜区、胞内区和胞外区组成[16]。通常情况下，HER-3 需要与家族中其他成员结合形成二聚体才能发挥其自身作用。有文献报道[17]，HER-3可以与磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）结合，激活下游信号通路，调节细胞增殖、黏附及迁袭。高表达状态的HER-3 可以促进肿瘤的发生发展，甚至可以调节肿瘤细胞地侵袭和转移。本研究结果显示，乳腺癌组织中HER-3 的表达水平高于癌旁组织（P ＜0.05）。其原因可能为HER-3 与家族成员HER-2 结合后，与PI3K 结合并激活下游信号通路，促进癌细胞的生长、分化等过程[18]。本研究结果显示，不同肿瘤细胞分化程度、TNM 分期及有无淋巴结转移的乳腺癌组织中HER-3 表达比较，差异有统计学意义（P ＜0.05）。机制可能为HER-3 可以抑制血管生成素-1 与血管内皮生长因子的表达，使得肿瘤生长分化功能降低，进一步使肿瘤分化等级降低，肿瘤恶性程度增高[19-20]。HER-3 的过表达，激活了Ras/Raf/MAPK 信号转导通路，当信息传导至细胞核内，使得基因转录增加，加快了上皮间质转化过程，促进了肿瘤细胞的浸润与转移过程[21]。HER-3 表达阳性的肿瘤细胞生长周期加快，肿瘤细胞更容易发生扩散及转移，并使上皮细胞运动能力增强，使得肿瘤细胞逃离原病灶，转移至其他组织中，进一步使得TNM 分期升高[22]。本研究结果显示，miR-155 与HER-3 的表达呈正相关（r=0.576，P ＜0.05），miR-155 的表达水平会随着HER-3 蛋白表达的升高而升高，提示两者在乳腺癌的发生发展中发挥协同作用，共同促进肿瘤细胞的增殖、分化及浸润的过程，但两者具体协同作用机制目前依然未能确切，有待后续增加大样本量继续探究。

综上所述，乳腺癌组织中miR-155 与HER-3 的表达与肿瘤TNM 分期、分化程度及淋巴结转移有关，有望在乳腺癌的诊断及治疗过程中提供可靠的科学依据。但两指标在乳腺癌发生过程中的具体作用机制还需要多中心的研究进一步探讨。