吸烟介导的COPD呼吸道微生态失调对Treg/Th17失衡的影响

王辉 叶彩虹 马焕丽 孙俊生 陈斯亮 张韶斌★

慢性阻塞性肺疾病（Chronic obstructive pulmonary disease，COPD）为临床最常见呼吸系统疾病之一，资料显示，烟草烟雾是COPD 的原发病因，尤其在高收入和中等收入国家，烟草烟雾是最大危险因素［1-2］。相关研究指出，吸烟可显著增加COPD 的发病率［3］。相关动物学研究发现，香烟烟雾暴露可能通过改变下呼吸道菌群组成引起宿主下呼吸道免疫反应改变，从而导致或促进肺部疾病的发生［4］。且有报道显示吸烟可通过影响稳定期COPD患者T 细胞17（T helper cell 17，Th17）与调节性T细胞（T regulatory cell，Treg）细胞表达加重炎症反应，最终影响患者病情及治疗［5］。基于此，本研究尝试探究吸烟介导的COPD 患者呼吸道微生态失调对Treg/Th17 免疫失衡的影响。报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取本院2018年9月至2020年6月30 例COPD 患者、30 例肺功能正常者作为研究对象，均符合COPD 诊断标准［6］。第1s 用力呼气肺活量/用力肺活量＞70%为肺功能正常。根据吸烟、肺功能情况分为4 组，本研究采用的吸烟定义：截至目前至少吸100 只香烟，且至少每月1 次，目前并未戒断。

纳入标准：①自主行为能力良好；②无沟通交流障碍；③无支气管哮喘及其他肺部疾病；④无肺部创伤史和手术史；⑤研究对象均知晓本研究，已签署同意书。排除标准：①恶性肿瘤患者；②自身免疫性疾病患者；③近三个月使用抗生素、免疫抑制剂和激素者；④高血压、糖尿病等慢性疾病患者；⑤近3 个月内有手术史、骨折史、严重创伤及感染性疾病史者；⑥血液系统疾病患者。

1.2 方法

所有研究对象均戒烟12 h，抽取清晨空腹状态下静脉血5 mL，抗凝处理后4℃保存备用。由高年资经验丰富医师采集肺泡灌洗液（Bronchoalveolar lavage，BAL）50 mL，4℃保存备用。①肺微生态菌群多样性检测：BAL 离心处理（500 g，4℃，离心10 min）后采用反复冻融法裂解细菌，采用Qiagen DNA提取试剂盒（离子交换法）提取DNA，然后由荧光聚合酶链式反应法进行鉴定，采用454 焦磷酸法对细菌16sRNA 进行测序，最后采用定量见解微生物生态学（Quantitative Insights into Microbial Ecology，QIIME）法［7］对16sRNA 进行数据分析（包括ACE 指数、Chao 指数、Shannon 指数、Simpson 指数，ACE指数、Chao指数）。②外周血及BLA中细胞及因子检测：取血清与BAL上清，采用酶联免疫吸附法检测白介素-10（Interleukin-10，IL-10）、IL-35、IL-17、IL-6、IL-8 水平，试剂盒购自北京百奥莱博科技有限公司。

1.3 观察指标

①4 组一般资料包括性别、年龄、体质量指数（Body mass index，BMI）比较；②肺微生态菌群多样性；③外周血、BAL 中Treg/Th17、中性粒细胞、单核细胞比较；④血清与BAL 上清中白介素-10（IL-10）、IL-35、IL-17、IL-6、IL-8 水平比较；⑤评价吸烟、肺微生态菌群、Treg/Th17 免疫失衡之间相关性。

1.4 统计学方法

采用SPSS 22.0 软件进行数据处理，计量资料以（±s）描述，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两组间比较采用SNK-q 检验，两组间比较采用独立样本t检验，相关性分析采用Spearman相关系数模型，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 4 组一般资料、肺微生态菌群多样性比较

4 组ACE 指数、Chao 指数、Shannon 指数比较：吸烟COPD 组＜不吸烟COPD 组＜吸烟肺功能正常组＜不吸烟肺功能正常组（P＜0.05），Simpson 指数比较：吸烟COPD 组＞不吸烟COPD 组＞吸烟肺功能正常组＞不吸烟肺功能正常组（P＜0.05）。见表1。

2.2 4 组PBMC、BAL 中Treg/Th17、中性粒细胞、单核细胞比较

4 组外周血、BAL 中Treg 细胞、Treg/Th17 比例比较：吸烟COPD 组＜不吸烟COPD 组＜吸烟肺功能正常组＜不吸烟肺功能正常组（P＜0.05），Th17 细胞、中性粒细胞、单核细胞比较：吸烟COPD 组＞不吸烟COPD 组＞吸烟肺功能正常组＞不吸烟肺功能正常组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表1 4 组一般资料、肺微生态菌群多样性比较［n，（±s）］Table 1 Comparison of the diversity of diversity in 4 groupss［n，（±s）］

表1 4 组一般资料、肺微生态菌群多样性比较［n，（±s）］Table 1 Comparison of the diversity of diversity in 4 groupss［n，（±s）］

注：与不吸烟COPD 组比较，aP＜0.05；与吸烟肺功能正常比较，bP＜0.05；与不吸烟肺功能正常组比较，cP＜0.05。

项目性别（男/女）年龄（岁）BMI（kg/m2）ACE 指数Chao 指数Shannon 指数Simpson 指数吸烟COPD 组（n=15）12/3 62.15±5.42 25.12±1.58 312.45±20.27abc 314.20±13.17abc 1.50±0.12abc 0.85±0.11abc不吸烟COPD 组（n=15）11/4 61.48±6.75 24.91±1.49 338.52±22.16bc 329.34±20.05bc 1.89±0.23bc 0.72±0.12bc吸烟肺功能正常组（n=15）10/5 59.96±5.51 24.75±1.42 396.73±28.81ac 372.55±24.17ac 2.54±0.35ac 0.52±0.08ac不吸烟肺功能正常组（n=15）9/6 60.62±6.68 24.18±1.60 512.14±31.34ab 508.39±31.68ab 4.13±0.41ab 0.30±0.05ab χ2/F 值1.587 0.369 1.048 174.107 216.622 225.186 97.896 P 值0.662 0.776 0.379＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001

表2 4 组PBMC、BAL 中Treg/Th17、中性粒细胞、单核细胞比较（±s）Table 2 Comparison of Treg/Th17，neutrophils and monocytes in PBMC and BAL in 4 groups（±s）

表2 4 组PBMC、BAL 中Treg/Th17、中性粒细胞、单核细胞比较（±s）Table 2 Comparison of Treg/Th17，neutrophils and monocytes in PBMC and BAL in 4 groups（±s）

项目外周血n 15 15 15 15 BAL组别吸烟COPD 组不吸烟COPD 组吸烟肺功能正常组不吸烟肺功能正常组F 值P 值吸烟COPD 组不吸烟COPD 组吸烟肺功能正常组不吸烟肺功能正常组F 值P 值15 15 15 15 Treg 细胞（%）1.21±0.22 1.80±0.43 2.76±0.51 3.40±0.67 60.691＜0.001 1.32±0.25 1.96±0.38 2.93±0.52 3.72±0.70 69.391＜0.001 Th17 细胞（%）6.82±0.83 6.12±0.65 2.57±0.40 1.22±0.21 335.794＜0.001 6.91±0.89 6.17±0.68 2.63±0.42 1.28±0.23 299.330＜0.001 Treg/Th17比例0.18±0.04 0.29±0.07 1.07±0.13 2.79±0.26 957.863＜0.001 0.19±0.05 0.32±0.08 1.11±0.14 2.91±0.27 928.693＜0.001中性粒细胞（×109/L）3.84±0.38 3.51±0.32 2.63±0.29 2.06±0.25 100.956＜0.001 4.26±0.57 3.79±0.48 2.95±0.39 2.28±0.31 57.822＜0.001单核细胞（×109/L）1.76±0.31 1.25±0.27 0.84±0.22 0.53±0.16 70.000＜0.001 1.93±0.25 1.34±0.21 0.88±0.17 0.59±0.14 132.315＜0.001

2.3 4 组血清、BAL 上清炎性因子比较

4 组血清、BAL 上清IL-17、IL-6、IL-8、IL-10 比较：吸烟COPD 组＞不吸烟COPD 组＞吸烟肺功能正常组＞不吸烟肺功能正常组（P＜0.05），血清、BAL 上清IL-35 比较：吸烟COPD 组＜不吸烟COPD 组＜吸烟肺功能正常组＜不吸烟肺功能正常组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表3。

2.4 吸烟、肺微生态菌群、Treg/Th17免疫失衡相关性

Spearman 相关性分析，吸烟与肺部菌群ACE指数、Chao 指数、Shannon 指数、外周血、BAL 中Treg 细胞、Treg/Th17 比例呈负相关，与Simpson 指数、外周血、BAL 中Th17 细胞呈正相关（P＜0.05），肺部菌群ACE 指数、Chao 指数、Shannon 指数与外周血、BAL 中Treg 细胞、Treg/Th17 比例呈正相关，与Th17 细胞呈负相关，Simpson 指数与外周血、BAL 中Treg 细胞、Treg/Th17 比例呈负相关，与Th17 细胞呈正相关（P＜0.05）。见表4～5。

3 讨论

吸烟是目前临床公认COPD 的主要危险因素之一，但吸烟通过何种机制增加COPD 发生风险，目前尚无定论。长期以来，受下呼吸道取样困难及传统微生物培养技术局限性的影响，临床普遍认为肺部是一个无菌的环境，随着支气管镜和rRNA 细菌鉴定技术的发展，发现肺部实际存在多种多样微生物菌群。且随着研究的深入，逐渐发现肺部微生态可显著影响慢性呼吸疾病的发生发展及临床治疗效果［8-9］。本研究结果提示肺微生态失调可能与COPD 的发生有关。进一步通过相关性分析发现吸烟与肺微生态菌群多样性存在明显相关性，提示吸烟可影响COPD 患者、肺功能正常人群肺部微生态菌群平衡。

表3 4 组血清、BAL 上清炎性因子比较（±s，pg/mL）Table 3 Comparison of inflammatory factors in serum and BAL supernatant of 4 groups（±s，pg/mL）

表3 4 组血清、BAL 上清炎性因子比较（±s，pg/mL）Table 3 Comparison of inflammatory factors in serum and BAL supernatant of 4 groups（±s，pg/mL）

项目血清n 15 15 15 15 BAL 上清组别吸烟COPD 组不吸烟COPD 组吸烟肺功能正常组不吸烟肺功能正常组F 值P 值吸烟COPD 组不吸烟COPD 组吸烟肺功能正常组不吸烟肺功能正常组F 值P 值15 15 15 15 IL-10 68.21±13.06 57.49±10.64 42.18±8.22 35.26±6.03 34.236＜0.001 72.14±15.12 59.13±11.44 45.07±9.02 36.19±6.27 31.211＜0.001 IL-35 117.45±15.34 138.04±22.51 189.16±30.55 242.37±42.39 54.001＜0.001 121.24±16.48 141.35±24.05 194.26±28.79 248.70±44.01 54.304＜0.001 IL-17 142.79±15.47 95.03±10.31 62.17±7.22 50.28±5.09 242.680＜0.001 161.52±18.55 101.37±12.79 65.09±8.14 52.26±5.63 237.328＜0.001 IL-6 35.18±7.79 19.29±5.05 13.75±4.10 8.31±2.46 74.031＜0.001 38.49±8.03 21.15±5.22 14.82±3.61 9.67±3.79 79.325＜0.001 IL-8 80.26±8.11 74.13±6.04 67.39±5.22 62.15±4.10 25.548＜0.001 85.31±10.25 76.02±7.21 69.10±5.69 63.45±4.31 25.595＜0.001

表4 吸烟与肺微生态菌群、Treg/Th17 免疫失衡相关性Table 4 The correlation between smoking and lung microbiota，Treg/Th17 immune imbalance

表5 肺微生态菌群与Treg/Th17 免疫失衡相关性Table 5 Correlation between pulmonary microbiota and Treg/Th17 immune imbalance

近年来研究显示，Th17/Terg 失衡与COPD 发病密切相关［10-11］。在COPD 中，Th17 细胞分泌高水平的IL-17，而IL-17 不仅能诱导单核巨噬细胞以及中性粒细胞在肺部聚集和活化，释放弹性蛋白酶以及金属蛋白酶等多种酶破坏肺组织，导致气道的炎症发生，还可诱导气道上皮细胞和内皮细胞分泌多种趋化因子和炎症因子，这些细胞因子可进一步促进COPD 的发展［12］。另外IL-17 还可促进支气管上皮细胞分泌大量的气道粘液、加重气道重塑及气道高反应性［13］。在炎症反应中，Treg 可诱导产生各种抑炎细胞因子，同时还能通过细胞间接触发挥抑制Th17 细胞免疫活性的作用，避免过度的免疫炎症反应加重组织损伤［14-15］。且本研究通过相关性分析发现Treg/Th17 平衡状态与肺微生态菌群多样性密切相关，提示Treg/Th17 失衡可引起肺微生态失调。本研究结果提示吸烟可诱导Th17 细胞增殖与活化并分泌高水平的IL-17，同时抑制Treg 细胞增殖。基于此笔者认为长期吸烟可影响肺部微生态菌群平衡，进而影响肺T 淋巴细胞分化，导致Th17/Terg 失衡，表现为Th17 细胞增多，分泌和活化大量的炎症因子和趋化因子，而Treg 细胞减少，免疫调节力度不足，最终炎症细胞及炎症因子在气道持续浸润，促进气道重塑，加重肺功能受限，因此吸烟-肺微生态失调-肺免疫紊乱-炎症浸润是吸烟致COPD 的发病机制。

综上可知，吸烟可介导呼吸道微生态失调，与Treg/Th17 免疫失衡密切相关，致使Naïve T 细胞分化失衡，可增加炎症因子和趋化因子，加重气道炎症浸润，最终促进COPD 的发病。本研究为单中心研究，存在样本量较少的不足，研究结果可能存在一定偏倚，仍需通过多中心、大样本研究进一步验证。