MSI、PD-L1在NSCLC患者中的表达及其与预后的相关性

张文静 章春芝★ 王贵刚 容宇 韩媛媛 陈丽君

程序性死亡配体-1（Programmed death ligand-1，PD-L1）为负免疫共刺激分子，在肿瘤细胞表面表达量较高，与肿瘤细胞免疫逃逸相关，利用PD-L1 阻滞机制可对晚期非小细胞肺癌（Non small cell lung cancer，NSCLC）患者进行有效治疗［1］。作为免疫治疗选择的可靠预测性生物标志物，已有研究表明PD-L1 表达水平与化疗效果密切相关［2］。微卫星DNA 广泛存在于人类基因组中，广泛用于基因定位分析。研究表明，微卫星不稳定性（Microsatellite instability，MSI）与肿瘤的发病密切相关［3］。不同分期NSCLC 患者MSI 状态存在差异，检测MSI对于NSCLC 患者病情及预后评估价值良好［4］。1996年国际上拟定了一个以BAT-25、BAT-26、二核苷酸位点（D2S123、D5S346、D17S250）为肿瘤组织MSI 检测的标志性位点，已有研究表明上述位点对NSCLC 患者MSI 的检测具有较高的敏感性及特异性［5］。因此本研究对MSI、PD-L1 表达水平及两者对NSCLC 患者预后的影响进行探究。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2010年6月至2014年12月在本院确诊86 例NSCLC 患者手术切除癌组织及对应距病灶5 cm 以上癌旁正常组织。其中男性52 例，女性34例；平均年龄（51.42±4.24）岁；低分化27 例，中高分化59 例；按国际抗癌联盟（Union for International Cancer Control，UICC）第8 版肺癌TNM 分期标准进行分期［6］，Ⅰ～Ⅱ期69 例，Ⅲ～Ⅳ期例；鳞癌48例，腺癌38 例。纳入标准：①按2008年美国国家综合癌症网络（National Comprehensive Cancer Network，NCCN）制定NSCLC 诊断标准［7］，经病理学检查或细胞学检查确诊为NSCLC 患者；②病史资料完整者；③术前未进行放疗或化疗者。排除标准：①合并其他原发癌症患者；②中途退出患者；③自身免疫性疾病及传染病患者；④其他不明类型肺癌患者。本研究经本院医学伦理委员会批准，受试者签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 基因组的提取及目的基因的扩增

细胞总DNA 的提取，采用GenoSton 公司生产基因组试剂盒MG706901 提取癌组织及癌旁正常组织细胞基因组。按表1设计引物，扩增试剂盒采用北京擎科兴业有限公司产（2XT5 Super PCR mix）按试剂盒上操作步骤扩增序列，完成后上样检测。

表1 MSI 引物序列Table 1 MSI primer sequences

1.2.2 PD-L1 免疫组化

兔抗人PD-L1 单克隆抗体（CD274）购自ThermoFisher 公司，具体操作照试剂盒说明书进行。

1.2.3 结果判定

MSI 判定标准［8］：对比正常组织PCR 扩增结果，条带正常为MSS，出现条带缺失判定为MSI，其中仅缺失1 条为MSI-L，缺失两条及以上为MSI-H。PD-L1 判读标准［9］：显微镜视野下随机取10 个视野，以每个视野中存在棕黄色颗细胞所占比例进行判定，≥50%为阳性，否则为阴性。

1.3 随访

所有患者随访资料均完整无缺失，随访时间5年，每6月进行一次电话或门诊随访。以患者手术期到随访截至日或死亡日之间时间计算患者生存期，对两组无进展生存期进行比较。

1.4 统计学方法

所有数据采用SPSS 16.0 统计软件进行处理。计数资料以n（%）表示，采用χ2检验；生存曲线采用Kaplan-Meier 绘制，以log-rank 检验；通过多元Logistic回归进行多因素生存分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 NSCLC 癌组织及癌旁组织中MSI、PD-L1 表达情况

NSCLC 肺癌组织MSI 阳性率高于癌旁组织，差异有统计学意义（P＜0.05）。癌组织PD-L1 阳性率相比癌旁组织明显升高，差异有统计学意义（P＜0.05），见表2、图1。

表2 NSCLC 癌组织及癌旁组织MSI、PD-L1 表达情况比较［n（%）］Table 2 Expression of MSI and PD-L1 in NSCLC and adjacent tissues［n（%）］

2.2 MSI、PD-L1 表达与临床病理因素的关系

MSI 各组及PD-L1 在肿瘤分化程度、淋巴结转移情况以及TNM 分期中的表达差异有统计学意义（P＜0.05），在年龄、性别、吸烟史、组织学分型中差异无统计学意义（P＞0.05）。见表3。

图1 NSCLC 患者癌组织PD-L1 免疫组化结果（Envision，×400）Figure 1 Immunohistochemical results of PD-L1 in cancer tissues of NSCLC patients（Envision，×400）

2.3 MSI、PD-L1 表达与预后的关系

所有86 例NSCLC 患者未出现失访情况，随访86 例患者5年总生存率为55.81%。MSS 阳性、MSI-L 阳性、MSI-H 阳性患者5年存活率分别为36.67%、58.33%、84.24%，MSI-H 阳性患者总生存时间明显大于MIS-L 阳性及MSS 阳性，差异有统计学意义（P＜0.05）；MSS 阳性及MSI-L 阳性生存时间比较差异无统计学意义（P＞0.05）。PD-L1 阳性患者术后5 生存率为44.83%，低于PD-L1 阴性组的78.57%，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图2。

2.4 NSCLC 患者生存期相关因素单因素分析

淋巴结是否转移、TNM 分期、肿瘤分化程度、MSI 表达情况、PD-L1 表达情况均与患者5年生存率有关（P＜0.05），年龄、性别、吸烟史、肿瘤组织学分型与患者5年生存率无关（P＞0.05）。见表4。

表3 MSI、PD-L1 与临床病理因素的关系［n（%）］Table 3 Relationship between MSI，PD-L1 and clinicopathological factors［n（%）］

图2 不同MSI、PD-L1 表达情况患者生存曲线比较Figure 2 Comparison of survival curves among patients with different MSI and PD-L1 expression

表4 NSCLC 患者生存期相关因素单因素分析［n（%）］Table 4 Univariate analysis of survival related factors in NSCLC patients［n（%）］

2.5 NSCLC 生存相关因素Logistic 回归分析

以5年生存率为应变量，以上述有统计学意义单因素为自变量赋值（MSI-H 阳性=0，MSS+MSIL 阳性=1；PD-L1 阳性=0，阴性=1；肿瘤分化程度低=0，中高=1；淋巴结转移=0，未转移=1；TNM 分期Ⅰ～Ⅱ=0，Ⅲ～Ⅳ=1）。Logistic表明，PD-L1 阳性、淋巴结转移、TNM 分期Ⅲ～Ⅳ期为影响患者5年生存率的独立危险因素，MSI-H 阳性为保护因素（P＜0.05），见表5。

表5 NSCLC 生存相关因素多元Logistic 回归分析Table 5 Multivariate Logistic regression analysis of survival related factors of NSCLC

3 讨论

目前常规治疗NSCLC 的方式包括手术切除、放疗、化疗以及最新的免疫治疗。大多数NSCLC 患者确诊时已属晚期，此时癌细胞已扩散，不适合进行手术治疗，只能采取化疗方式以缓解症状，但治愈率较低。

DNA 错配修复（mis-match repair，MMR）是DNA 错配修复系统中的重要部分，当机体出现MMR缺陷时，DNA 错配修复功能丧失，导致基因中短片段重复序列发生突变即MSI。研究表明，当机体处于MSI 状态时，致癌基因激活异常、抑癌基因失活，正常细胞基因突变不断累积，大量突变产生，细胞异常增殖导致肿瘤的产生［10］。MSI 状态可通过MSI 位点进行检测，对比正常癌旁组织，结果显示一条及以上条带增加或缺失即为MSI 阳性［11］。黎琪等［12］研究发现，结直肠癌患者癌组织样本中MSI 阳性检出率为73.21%，远高于正常组织。Warth 等［13］研究表明，NSCLC 患者癌组织MSI 与PD-L1 存在相关性。国外已有研究证实，利用上述位点对NSCLC 中MSI 检测具有良好的敏感性及特异性［14］。同时，本研究结果表明NSCLC 患者淋巴结是否转移、肿瘤分化情况、TNM 分期对MSI 的表达存在一定的影响。同时MSIH 阳性表达患者生存期明显高于MSS、MSI-L 阳性患者，且MSI-H 阳性为NSCLC 患者5年生存率的保护因素，表明MSI 表达情况与患者预后相关，提示MSIH 可能成为NSCLC 患者预后评估的良好指标。

PD-1 为免疫抑制剂的一种，可与PD-L1 相互作用调控机体免疫反应。肿癌细胞表面PD-L1 含量上升，大量的PD-L1 加速与PD-1 受体结合，导致效应T 细胞增殖速度减慢并诱导细胞迅速凋亡，降低T细胞对癌细胞的免疫反应，癌细胞迅速增殖［15］。吴涵等［16］研究表明，NSCLC 患者的PD-L1 阳性表达率为62.2%，与本研究结果相似。本研究结果显示PD-L1 表达与淋巴结是否转移、TNM 分期以及肿瘤分化程度有关，与年龄、性别、是否吸烟、肿瘤组织学分类无关，与高锋等［17］研究基本相似。本研究结果提示利用PD-L1 作为NSCLC 预后的预测指标具有良好的价值，临床对NSCLC 患者PD-L1 表达情况的检测可作为患者预后评估的重要依据。

综上所述，NSCLC 患者MSI、PD-L1 水平明显升高，其表达水平与病理特征密切相关；MSI、PD-L1阳性患者5年生存率显著低于阴性患者，其表达水平与患者预后存在明显相关性。