斑马鱼血管性认知障碍模型的建立研究

刘 琳，王伟佳，杨寓迪，康靖飞，王冬雪

(哈尔滨商业大学 药学院，哈尔滨 150076)

血管性认知障碍主要由脑缺血缺氧损害所引起，是致老年性痴呆的重大原因，且分类较多，按病因可分成：神经病变性急性、脑血管病、代谢障碍疾病等，其发病率仅次于阿尔茨海默病，是脑血管病后产生的进行性智能障碍综合征[1].现今相关研究愈来愈热，其中大鼠模型是最为常见的，但其存在模型建立周期长费用昂贵等缺点[2].斑马鱼作为一种新型模式生物，以其胚胎和幼鱼透明易观察、个体小易于饲养、繁殖周期短、产卵量大、卵子体外受精和发育、对药物敏感、适合高通量药物的筛选等优点，目前广泛用于人类疾病的研究中，已成为疾病研究的最佳模式生物之一[3].目前建立血管性认知障碍模型方法主要有2-VO法、3-VO法、低压缺氧法、化学试剂法、急性重复缺氧法等[4].而现今对斑马鱼的缺氧痴呆模型探究较少，鉴于实验室前期成功建立阿尔茨海默症模型基础，本实验采用鼓泡法的方式摸索斑马鱼在不同条件下造成痴呆的程度，通过氮气鼓泡法建立缺氧模型，并检测其T迷宫、社交行为、神经生化指标来探究其发病过程，这样可以更加有效的了解人发病的情况，为实验室后续研究提供依据.

1 实验部分

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物及分组

野生型 AB 系成年斑马鱼 120条，购自武汉国家斑马鱼资源中心，野生健康红色斑马鱼 20 条，购自 ×× 花鸟鱼市场.所有斑马鱼均 6～8 月龄，体长 2.5～3.5 cm，饲养于独立的循环养殖系统，水温恒定在 (28±0.5)℃，pH 值为 6.8～7.5，电导率为 450～550 μS/cm，光照/黑暗周期为 14h∶10h，每日定时喂食 2 次冰冻丰年虾.将120条野生型 AB 系成年斑马鱼随机分为对照组(n=60)、氮气模型组(n=60).

1.1.2 实验仪器及设备

酶标分析仪(RAYTO公司)，紫外可见分光光度计(尤尼柯仪器有限公司)，斑马鱼 T 迷宫(View Point 公司)，斑马鱼社交箱(View Point 公司)，红外线照明系统 50 cm(View Point 公司)，斑马鱼养殖系统(上海海圣生物实验设备有限公司)，净化供水单元(RO 纯水机)(上海海圣生物实验设备有限公司)，笔试溶氧仪(上海亚荣生化仪器厂).

1.1.3 实验试剂

零氧试剂，总蛋白(TP)测定试剂盒，总超氧化物歧化酶(SOD)测定试剂盒，微量丙二醛(MDA)测定试剂盒，谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)，过氧化氢酶(CAT)测定试剂盒.

1.2 实验方法

1.2.1 氮气模型

1)氮气模型建立

在实验开始前，将高纯氮气以大流速充入装有 500 mL纯净水的广口瓶中，实时用溶氧仪检测水中的溶氧量直至降到 0.5 mg/L 以下，达到斑马鱼缺氧环境.将模型组放入广口瓶中，并继续以200 mL/min 的流速向装有模型组的广口瓶中充入高纯氮气5 min，计时结束后将气管拿出并用保鲜膜密封放置，8 h 后再一次进行氮气缺氧，每天相同时间点，每天 2 次，连续充 60 d.

2)氮气模型溶氧量

溶氧含量是指水中氧气的溶解量，斑马鱼是通过溶解在水中的氧气呼吸生存的，溶氧量在水中生存的重要指标之一.溶氧仪可以用来检测现场或实验室内被测样品水溶液内的溶氧含量，通过溶氧电极将产生氧化反应，由此生成的扩散电流和溶液中的氧呈一定关系的原理制作，用于测量水中氧气含量，根据测量数据指标可以更直观有效的看到斑马鱼是否达到低氧、缺氧指标.因此本实验通过使用溶氧仪检测每次氮气鼓泡实验前后水中的溶氧含量，从而更直观有效的观察斑马鱼所处的环境是否达到低氧，缺氧的指标.

1.2.2 T迷宫行为学检测

以实验室前期建立的T迷宫实验方法为标准[5]，于建立模型后的 30、45、60 d 进行学习记忆能力检测.1)适应性训练：将整组斑马鱼放入 T 迷宫中自由活动，不设置 EC 区，每组适应1 h .2)实验前期准备：实验前向迷宫中注入斑马鱼养殖水直到短臂相比于其他位置水位高6 cm ，短臂的两端分别用红色、绿色卡纸包住，左臂用绿色卡纸包住后设置为目标臂并在底部铺满白色砂石，臂中加入人工绿植.3)训练及测试期：每天早上 8∶00 在相同时间点进行实验，将 1 条斑马鱼放到通道起点处，观察并记录鱼在6 min 内从起点到第 1 次进入 EC 区的潜伏期(当鱼找到并停留30 s 后才算进入了 EC 区)，并在 EC 区内给予食物奖赏.未找到 EC 区的鱼，6 min 后引导其进入 EC 区并停留30 s，同样给予食物奖励.每天鱼都有一个对应编号的独立小鱼缸，测试完后放回原组中.每天1次，每天训练 6 min ，连续训练 4 次，第 5 次为测试期.实验期间在夏天进行，并保证T迷宫未受室内光源光照的影响，周围外部环境安静.

1.2.3 社交实验检测

于建立模型后 30、45、60 d 测试斑马鱼社交行为[6]，全程在社交箱中进行.实验开始前1 h将整组斑马鱼分别在独立小鱼缸进行被测鱼单独隔离，避免实验时激发出更多社交行为.社交行为箱中注入养殖水直至水位在8 cm，隔离完毕后开始正式实验，将社交鱼(野生红色斑马鱼)放入社交箱后，再取模型组中1条被测鱼放入，让2条鱼适应并进行社交，实验时间为7 min ，前5 min 适应熟悉并记录后2 min 的接触时间及次数，被测鱼追逐社交鱼时接触记为追逐、社交鱼追逐被测鱼时接触记为被追逐、2条鱼互相交流接触时记为互相，为避免社交鱼出现社交疲乏状态，同1条社交鱼跟3条被测鱼进行社交行为测试，也可保证其实验的随机性，测试后放回原组中，每天1次，连续4次.实验期间确保实验室内灯光、物品等空间参照物位置摆放不变，其他实验人员不得发出噪声及进行走动.

1.2.4 神经生化指标检测

1)样品采集处理

模型建立后 60 d ，将对照组氮气组进行样品采集.将鱼置于冰上，待鱼麻醉后快速取脑，准确称重，按照质量(g)：体积(mL)=1∶9的比例制备10%匀浆，采用低温高速离心机在2 500 r/min 离心10 min，取上清液用于生化指标的检测.

2)检测指标

按照总蛋白(TP)测定试剂盒、总超氧化物歧化酶(SOD)测定试剂盒、微量丙二醛(MDA)测定试剂盒并按照说明说同比例稀释后测定.

1.2.5 数据处理

2 实验结果

2.1 氮气模型溶氧量检测

采用溶氧仪分别在氮气鼓泡实验前、实验后进行连续60 d 监测.在氮气鼓泡后的溶氧量有一定波动，数据显示明显比实验前低，并且较稳定的保持在低氧状态下，见图1.

图1 60 d 内溶氧量变化

2.2 氮气模型T迷宫实验结果

T迷宫实验结果如图2所示，与对照组相比，氮气组 45、60 d 均出现显著性差异(P<0.01)；与30 d相比，对照组在60 d出现非常显著性差异(P<0.01)，氮气组在45 d为时间转折点出现非常显著性差异直至60 d(P<0.01).

图2 30、45、60d氮气组测试期结果

2.3 社交接触时间

30 d社交接触时间结果显示，与对照组相比，氮气组追逐时间有显著性下降(P<0.01)、互相交流时间在第 2 次和第 4 次出现非常显著性下降(P<0.01)；45 d社交接触时间结果显示，与对照组比较，氮气组追逐时间非常显著性下降(P<0.01)；60 d社交时间结果显示，与对照组相比，氮气组并无追逐接触出现显著性下降(P<0.01)、被追逐时间在第 3 次、第 4 次出现显著性上升(P<0.01).见表1～3.

表1 30d 斑马鱼社交接触时间

表2 45 d 斑马鱼社交接触时间

表3 60 d 斑马鱼社交接触时间

2.4 社交接触次数结果

30d 社交接触次数结果显示，与对照组相比，氮气组追逐次数显著性下降(P<0.05)、互相交流时间在第 4 次出现非常显著性下降(P<0.01)；45d 社交接触次数结果显示，与对照组相比，氮气组追逐次数非常显著性下降(P<0.01)；60d 社交接触次数结果显示，与对照组相比，氮气组并无追逐接触出现非常显著性下降(P<0.01)，见表4～6.

表4 30 d 斑马鱼社交接触次数次)

表5 45 d 斑马鱼社交接触次数次)

表6 60 d斑马鱼社交接触次数次)

2.5 含SOD、MDA量检测结果

SOD活力是通过测定 SOD 抑制率得到，与对照组相比，氮气组有显著性下降(P<0.05)；含MDA 量测定通过与硫代巴比妥酸缩合，与对照组相比，氮气组有显著升高(P<0.05)，测定结果见图3.

与对照组相比，*P<0.05 显著性差异

3 讨 论

斑马鱼是一种小型热带淡水硬骨鱼，具有体型小、易于饲养、管理且实验成本低、样本小，可进行体外受精和培养，胚胎透明，易于观察，繁殖周期短，且一次有较大的产卵数量等特点[7-8].斑马鱼作为新型模式动物，其筛选周期短，也是较其他生物、化学模型和体外细胞模型具有绝对的优势[9-10].近年来在各类研究领域发挥着越来越重要的作用[11].目前，斑马鱼已被广泛地用于药理学、发育生物学、分子生物学、细胞生物学、遗传学、神经生物学、肿瘤学、免疫学、海洋生物学、药物学、毒理与环保等诸多方面的研究，一些重要的成果不断涌现，为现代医学生命科学的发展做出了重要贡献[12].T迷宫实验已经成为现今实验室最经典、最常用评价斑马鱼学习记忆能力的检测手段，可以检测其斑马鱼学习及记忆能力，能提供较多的实验指标和参考[13].

本研究采用氮气鼓泡法建立氮气缺氧模型，氮气模型流速可以很好的模拟贴近人缺氧发病的过程，但是也有一定的缺点对于氮气流速的控制较难把控，也是建立此模型的难点.通过T迷宫、社交实验检测学习记忆能力与社交实验能力在30 d时出现认知障碍并持续至60 d，随时间加重也并未出现反复.SOD能催化超氧化物阴离子发生歧化作用，活性的高低反映了机体抗氧化能力大小，是生物体内一种重要的抗氧化酶[14]，MDA是生物脂质氧化的天然产物之一，含MDA量反映了机体细胞脂质过氧化程度的严重[15].本实验结果显示斑马鱼脑内SOD活力降低，升高MDA活力引起脑内脂质过氧化.因此模型组斑马鱼SOD活力降低，MDA活力升高所引起的脑内脂质过氧化，有可能是造成斑马鱼血管认知障碍的原因之一.

综上所述，氮气鼓泡法可以作为一种行之有效的造模方法来建立斑马鱼的血管认知障碍模型.使用该方法，能够为实验室后续对相关疾病的研究提供全新的选择，为后续实验提供重要的理论参考，由于模型处于建立初期，模型的形成原因还有待发掘，因此该模型依然有着巨大的改良空间.