叶绿素a分光光度法测定探讨

邹 敏，蹇 川，李文俊

（重庆市生态环境监测中心，重庆 401147）

关键字：叶绿素a；方法；探讨

湖泊富营养化已成为最重要的水环境问题之一，叶绿素a是反映富营养化的重要指标，一级生态区湖泊营养主要考虑湖泊生态系统受气候和地理因素的影响。对于湖库样品，叶绿素a是判定湖库水质好坏的重要指标之一，是衡量藻类生物量的最重要指标，与总氮、总磷有直接关系[1]。湖库的富营养化也叫水华，在外观上主要表现为水体呈红色、棕色等。一般来说，水体富营养化后，透明度会降低，厌氧条件会产生有害气体，进而伤害水体里的生物，导致水生物种类减少，水生态系统被破坏。

本文以水体中叶绿素a的含量为例，探讨叶绿素a测定时间的相关影响因素。在采样时，应在500 mL或1 000 mL的棕色采样瓶中加入碳酸镁悬浊液，碳酸镁溶液的加入，以每升水样加入1 mL为宜，主要是为了防止酸化引起色素沉淀。样品采回后，应冷藏避光存放，并尽快分析，其主要原理是将样品过滤后，通过丙酮提取，并将提取液离心后，用分光光度计进行测定吸光度，根据吸光度计算样品含量。

在《地表水环境质量标准》（GB2002-3838）中并没有叶绿素a的相关标准，经济合作与发展组织规定，3 μg/L以下的是贫营养，11～78 μg/L的是富营养，78 μg/L以上的是重富营养。要想控制好水质，消除水华现象，最重要的就是监控好叶绿素a的质量浓度[2]。因此，监控好叶绿素a的水质状况，对湖库水环境质量的提升意义重大。

1 实验条件探究

我们严格按照河湖岸线进行保护，高标准推进“两江四岸”生态修复、滨水空间建设要求，要使湖库水质变好，分光光度法测定叶绿素a是最重要的关键环节，750 nm处吸光度应小于0.005。本文通过对研磨方法、不同分光光度计的型号、滤膜型号的对比等，得出了最佳实验条件。为了得出最具说服力的数据，应在不同采样季节、不同采样温度、不同采样条件下，采用同样的监测方法得出不同的数据，并研究了750 nm处吸光度值的差异。在研磨时，放置于组织研磨器中研磨，其优于玻璃研磨器研磨，并分三次加入丙酮溶液，研磨后离心机的转速也会影响提取结果，浸泡提取时应定容至10 mL，用锡箔纸包装好，冷藏2～24 h；在抽滤时，采用玻璃纤维滤膜，轻轻颠倒混匀样品，在完全抽滤后，将滤膜对折，用滤纸吸干，如不能及时分析，应将滤膜冷冻存放在冰箱，并于14 d内分析完毕。

1.1 仪器、材料及试剂的准备

本次实验用到的试剂主要有90%的丙酮溶液、碳酸镁悬浊液、有机相针式滤器、0.45 μm滤膜、离心机、抽滤器、1 cm比色皿、离心管、铝箔纸；仪器主要包含紫外可见分光光度计UV-2600、离心机、震荡提取仪，所用试剂为Anrqur Chemicals Supply的丙酮、成都市科隆化学品有限公司的碳酸镁等[3]。

各种叶绿素之间的差别在于和吡咯环相连接的侧链结构有所不同。叶绿素a和叶绿素b的区别在于第Ⅱ吡咯环上第三碳位上的取代基R′的不同。叶绿素分子的上端金属卟啉环中，镁原子偏向于带正电荷，而氮原子带负电荷，呈极性，因而具有亲水性。叶绿素不溶于水，但溶于乙醇、丙酮、和石油醚等有机溶剂。大多数植物体中叶绿素a的含量比叶绿素b的含量多2～3倍。

1.2 方法检出限和测定下限测试数据

对于采用低浓度的样品，在装好玻璃纤维滤膜的过滤装置上进行抽滤，用少量蒸馏水冲洗器壁，在抽滤结束后，用镊子将滤膜取出，对折，用滤纸吸干，将滤膜置于研磨装置中，加入3～4 mL丙酮，研磨至糊状，并重复1～2次，保证充分研磨5 min以上，并将完全研磨的提取液转移至玻璃刻度离心管中，用丙酮溶液冲洗研钵及研钵棒，一并转入离心管中，定容至10 mL，将离心管放入离心机，以相对离心力4 000 r/min离心10 min，然后用针式滤器过滤上清液得到叶绿素a的丙酮提取液，以丙酮作参比，在波长750、664、647、630 nm处测量吸光度，平行测定7次，如表1所示。

表1 方法检出限和测定下限测试数据

1.3 方法精密度测试数据

采集两种不同浓度的水样按照标准方法分别进行6次测定，其测试数据见表2。

表2 方法精密度测试数据

1.4 实际样品测试数据

实际样品测试数据见表3。

表3 实际样品测试数据

1.5 方法验证结论

在本次验证方法中，实验验证人员对该标准方法进行了学习培训，实验室所用仪器设备均在检定有效期内，在实验过程中均使用符合国家标准的试剂，实验环境满足方法要求，未受到其它项目干扰。750 nm吸光度小于0.005，满足标准要求；实验所得方法检出限为1 μg/L，测定下限为4 μg/L，小于方法检出限2 μg/L的要求；精密度、实际样品满足分析要求。实验室检测结果准确可靠，人员操作熟练，技术水平符合要求，已满足该方法的各项条件。

2 方法注意事项

在采样时要注意采集平行样，实验时按照10%的平行双样，当样品数量在20个以内时应有一个实验室空白，平行双样的相对误差应小于20%。在运输采集样品的过程中应避免样品被玷污、损失和丢失；在样品交接和发放环节，应确保无遗漏，保证样品与标签的一一对应，并符合相关技术标准。叶绿素a的结果与采样量有关，当为中营养或富营养时，最小过滤体积取100～200 mL，当为贫营养时，最小过滤体积取500～1 000 mL，采样用棕色玻璃瓶，采样时加入的碳酸镁悬浊液以1.0 g碳酸镁加入100 mL去离子水进行配制，使用前应充分摇匀。丙酮应采用分析纯或色谱纯，滤膜为玻璃纤维滤膜，在抽滤时负压不超过50 kpa，抽滤完后需用去离子水冲洗滤膜。

将过滤后的滤膜放置于玻璃离心管中，加入10.0 mL丙酮溶液，在振荡器中，以3 000 Hz震荡5 min，待充分震荡摇匀后，将离心管用铝箔包好，并放置于4 ℃冰箱中冷藏[4]。在浸泡过程中要注意反复颠倒摇匀2～3次，冷藏时间不宜超过24 h，达到冷藏时间后要以滤膜过滤，用在分光光度计测定滤液的吸光度，在分析过程中，特别需要注意的是，750 nm的波长应小于0.005。

在监测时丙酮有一定危害，要注意防止皮肤接触，在通风橱中操作，所使用的比色皿和玻璃器具不应用酸浸泡或洗涤。叶绿素的实验房间应避光，如果750 nm波长处的吸光度值大于0.005，应重新过滤，重复操作，直至吸光度值小于0.005，在测定时，应将分光光度计置于通风橱中，保证人体不受危害。

如果不采用震荡提取仪，而采用玻璃研磨器的话，样品在流转过程中会有所损失，而且丙酮危害极大。在研磨过程中应防止丙酮挥发，实验分析中应带上全程序空白样和实验室空白样。测定结果报整数，并且不超过三位有效数字。完善三级审核，严格按照数据处理相关规定进行计算，记录测定数值时，应同时考虑计量器具的精密度、准确度和读数误差，对检定合格的计量器具，最多保留一位不确定数字。精密度一般只取1～2位有效数字，在审核报告时应对采样、分析环节进行逐一审核，通过对采样状况、历史数据情况、逻辑关系、连续多次监测结果的数据比较，对不符合或异常的数据要进行合理分析，在监测结果低于方法检出限时，用2 L表示，报告审核完毕后，按照报告管理和发放程序进行归档管理。