冷鲜肉微生物种类及微生物预测模型的研究进展

邓森荣，向 蓉，魏琦麟，康桦华，彭新宇，袁明贵，徐志宏

（1.仲恺农业工程学院动物科技学院，广东 广州 510225；2.广东省农业科学院动物卫生研究所，广东 广州 510640；3.岭南现代农业科学与技术广东省实验室肇庆分中心，广东 肇庆 526100）

我国是肉类生产和消费大国，肉类总产量占全世界总产量1/3 左右。据国家统计局数据显示，我国2019 年猪牛羊禽肉产量7649 万t，其中猪肉产量4255 万t，牛肉产量667 万t，羊肉产量488 万t，禽肉产量2239 万t［1］。

目前，市场上的肉品主要有热鲜肉、冷冻肉、冷鲜肉3 种形式。热鲜肉，指在凌晨进行屠宰后直接在农贸市场进行售卖的鲜肉。由于地区消费习惯的差异，南方人热衷于购买热鲜肉。刚放血屠宰的牲口在随即发生的僵直过程中会升温，导致畜体温度比活体温度高，加上肉的丰富营养，为细菌繁殖提供了一个良好环境［2］。冷冻肉指贮藏环境低于-18℃的肉品。低温抑制了微生物的繁殖，有利于长期保存食物，同时由于便利储运，因此在市场占有一定份额。但是冷冻肉在解冻过程中，会造成营养流失，以及由于长期冻存会导致肉类的口感变差，因此在市场上不太受消费者喜爱。冷鲜肉，是指屠宰后24 h 内使肉中心的温度降到0～4 ℃，并在后续的贮存和运输过程中都保持在0～4 ℃之间。与热鲜肉相比,冷却猪肉遵循肉类生物化学基本规律，在适宜的温度下,使屠体有序地完成了尸僵、解僵、软化和成熟的过程,肌肉蛋白质正常降解，肌肉排酸软化，嫩度明显提高，非常有利于人体的消化吸收，且因其未经冻结，食用前无须解冻，不会产生营养流失，同时由于冷却猪肉始终处于低温环境下，有效抑制了微生物的生长，尤其是病原菌几乎不产生毒素。冷鲜肉在我国越来越受欢迎，逐渐成为我国居民肉类消费主流，但货架期短始终制约着冷鲜肉的发展［3］。我国居民的饮食习惯讲究食材新鲜，对肉类的色泽、新鲜度要求较高，从食品安全以及市场需求的角度出发，冷鲜肉无疑最有发展前景。近年来，冷链物流的发展保证了肉产品从加工源头到销售市场的新鲜程度。但相对于发达国家而言，我国的冷链运输系统相对落后。冷链物流控温在4 ℃左右，研究表明，微生物仍然保持一定的生长速率。如何选择一个合适温度并保持恒定，尽可能保持肉品营养且最有效地抑制微生物生长是当前研究的方向和难题［4］。

肉类在屠宰加工的过程中受到影响的因素较多，现代屠宰工艺不断改进以避免微生物污染，但屠宰、运输、包装、销售等环节不可能做到无菌操作，接触到肉类的微生物繁殖生长，缩短了肉类的货架期，导致肉类腐败［4］。在此背景下，建构微生物预测模型从而建构货架期预测模型显得尤为重要与迫切。

1 肉类中存在的微生物概况

由于环境污染或者肉类动物自身的病害导致食用肉类上存在不同种类的微生物，主要包括细菌、病毒和寄生虫。

肉类中的细菌主要分为致病菌与腐败菌两类，腐败菌会使肉类腐败变质，缩短其货架期，其中肠杆菌是肉品腐败的最重要因素［5-6］；致病菌不仅使肉类腐败变质而且产生有毒物质或毒素，食用后会造成食物中毒等严重后果。健康机体肌肉中本身是无菌的，因此肉类上的细菌都是在生产、加工、运输的过程中污染的［7］，主要包括假单胞菌属、希瓦氏菌属、不动杆菌属、莫拉克斯氏菌属、嗜冷杆菌属、产碱杆菌属［8］、肠杆菌属、弧菌科中的气单胞菌属和弧菌属、黄杆菌属、葡萄球菌属、微球菌属、梭菌属、乳酸杆菌属、明串珠菌属、环丝菌属、棒状杆菌属［9-10］。

病毒是一种比细菌更微小、只含一种核酸、只能寄生于活细胞内生长繁殖的微生物，是最小的生命形态。病毒虽然结构简单，形体微小，却能使人和动植物生病甚至死亡。例如，口蹄疫病毒可造成牛、猪、羊等家畜口腔发炎及蹄部溃烂，造成家畜大规模死亡，导致巨大的经济损失。肉类中存在的病毒主要有朊病毒、禽流感病毒、口蹄疫病毒、诺瓦克病毒、冠状病毒等。据研究报道，引起新型冠状病毒肺炎的新型冠状病毒存在于食物上，例如水产品，对人类健康造成巨大的威胁以及导致全球经济巨大的损失［11］。

寄生虫病是我国重要的公共卫生问题，肉类食品中常见的寄生虫主要有以下几种［12］：（1）旋毛虫，即旋毛形线虫，是一种人兽共患的寄生虫，几乎能感染所有的哺乳动物。（2）绦虫，是一种可以引起食源性疾病的寄生虫，主要有猪肉绦虫、牛肉绦虫、细粒棘球绦虫以及阔节裂头幼虫等，其中猪肉绦虫和牛肉绦虫在我国广泛分布。人往往是寄生虫的最终宿主，当食用没有煮熟的食物或者直接吃生肉，就很容易感染寄生虫。（3）异尖线虫，寄生于海产鱼内脏和肌肉内。进入人体的幼虫不变成虫，而是在胃肠内形成一种被称为好酸球性肉芽肿的病变。（4）曼氏裂头蚴，青蛙、蛇等体内大量存在，也会存在于家禽以及猪、马、牛等体内，喝了不洁净的水以及食用没有煮熟的肉均有可能感染。（5）肉狍子虫，一种常见于食草动物中的寄生虫，最初在猪身上发现。（6）肝片吸虫，畜牧区的家畜发病率比较高，可致人肝吸虫病。（7）蛔虫，人体内最常见的寄生虫，可致蛔虫病。（8）弓形虫，宿主是猫，携带者包括了很多恒温动物。

随着我国医疗卫生系统的不断完善，医疗卫生水平的不断提高以及人们医疗卫生意识的不断增强，对病毒以及寄生虫的防控取得了显著成效。而冷鲜肉的细菌污染是在生产、运输以及销售的过程当中造成的，往往由于整个过程中环境条件的限制，细菌污染具有不可避免性。很多发达国家在冷鲜领域的技术已经很成熟，可通过检测特定腐败菌，构建微生物预测模型。总体而言，市场对货架期预测领域的实际应用需求迫切，国内冷鲜领域的发展水平有待提高，研究冷鲜肉上的细菌，构建细菌微生物预测模型具有重要意义。

2 不同冷鲜肉类中存在的细菌种类

2.1 猪肉

冷鲜猪肉中常见的腐败菌有假单胞菌属、莫拉氏菌属、不动杆菌属，气单胞菌属和兼性厌氧的肠杆菌科，以及革兰氏阳性的葡萄球菌属、乳杆菌属和热死环丝菌属等。此外肉品中也有少量芽孢杆菌、霉菌和酵母菌，但其致腐能力较低。

朱维军等［13］利用细菌的分离与鉴定等技术研究冷鲜猪肉中的腐败菌，结果表明，冷却肉品中的腐败菌主要有乳酸菌、肠杆菌科、假单胞菌、热杀索丝菌和李斯特氏菌，这些微生物影响冷却肉的食用安全。李宁［14］以冷鲜肉为研究对象，分析冷鲜肉新鲜度随存储时间的变化，同时对存储期间微生物的多样性进行研究，发现假单胞菌属、不动杆菌、发光杆菌属是冷鲜肉样品中的优势腐败菌，其中发光杆菌很少被报道与肉类腐败有关。何帆［15］研究冷鲜猪肉品质变化时发现，假单胞菌增殖速度快，是典型的嗜冷菌，能在低温下生长，具有很强的产氨腐败能力，是猪肉腐败的主要原因；在3 种贮藏温度条件下（4、7、10 ℃），葡萄球菌数变化没有显著差异，说明温度对冷鲜肉中的葡萄球菌影响不大；而乳酸菌有显著变化，说明低温可以显著抑制贮藏冷鲜肉中的乳酸菌生长繁殖；同样的3 个温度条件下，酵母菌则难以生长。熊丹萍等［16］在比较不同冷鲜猪肉产品菌相组成中表明，冷鲜猪肉中的主要微生物包括假单胞菌、热杀索丝菌、乳酸菌、微球菌和肠杆菌属。刘燕［17］对168 份猪肉样品进行历时3 个月的微生物检测，结果表明，菌落总数在102～103CFU/g 之间的有42 份，大肠杆菌菌群最可能数MPN ＜30 的有30 份，占抽样总数的17.9%；菌落总数在104～106的有126 份，占抽样总数的75%；大肠杆菌菌群MPN 在30～100 之间的有138 份，占抽样总数的82.1%。刘寿春等［18］通过对超市销售货架的冷却猪肉进行微生物分析，结果显示，假单胞菌和热杀索丝菌是冷却猪肉的主要腐败菌，两者均能在低温生长并代谢腐败产物。赵丽珺等［3］在冷却猪肉中特定腐败菌的靶向筛选研究中发现，4 ℃条件下贮藏的猪肉初期细菌总数103.98CFU/g，第5 天细菌总数为106.06CFU/g，已经超出了我国对冷鲜肉菌落总数的要求（≤106CFU/g）。

2.2 牛肉

我国传统的牛肉生产一般在宰杀后不经冷却加工即于当天以热鲜肉的方式进行销售，此法简单方便，但由于温度较高，微生物得不到有效抑制，导致牛肉易污染，从而保质期缩短，而且不能批量生产［19］。冷鲜牛肉中微生物腐败菌的研究对牛肉贮藏以及消费模式有重大影响［20］。牛在屠宰过程中的微生物污染源可分为剥皮前、屠宰、分割3 个环节。研究表明，通常情况下，冷却牛肉中仅有10%的初始细菌能够在贮藏过程中存活，且仅有很少一部分细菌发挥腐败作用，这部分细菌称作优势菌。这些腐败菌包括革兰氏阴性假单胞菌、不动杆菌、气单胞菌、腐败希瓦氏菌和肠杆菌等，以及革兰氏阳性乳杆菌、热杀索丝菌等［21］。

李娟等［22］分析肉牛屠宰车间空气以及相关屠宰工序中工人手、工具、冲淋水等菌相分布，确定出厂前牛肉主要污染工序和初始微生物来源，结果表明，出厂前牛肉主要携带约氏不动杆菌、巨型解酪球菌、葡萄球菌等。陈锐颖［23］研究表明，真空包装牛肉在冰温贮藏条件下达到贮藏终点时，乳酸菌的数量最多、达到8.54 lg（CFU/g），其次是假单胞菌、为8.28 lg（CFU/g），热死环丝菌和肠杆茜的数量较少、分别为7.12l、6.51 lg（CFU/g），证实乳酸菌是真空包装的主要腐败菌，而假单胞菌为有氧贮藏条件下的主要腐败菌；同时肠杆菌也是肉制品的主要腐败菌，但在真空包装的牛肉中数量较少。张秀凤等［24］为了确认冷鲜牛肉的腐败临界期及特定腐败菌，将冷鲜牛肉置于1～4 ℃下保存，结果表明，在贮藏牛肉第9 天，牛肉已经是次鲜肉，接近腐败，第10 天时已经变质；同时通过牛肉腐败菌的选择性培养，最终确定冷鲜牛肉中优势腐败菌为乳酸菌、热死环丝菌和肠杆菌。顾春涛等［25］研究发现，冷鲜牛肉中的特定腐败菌主要为假单胞菌、热死丝环菌以及肠杆菌。

2.3 禽类肉品

一般健康禽类冷鲜肉的内部组织并没有腐败菌的存在，活禽本身的防御机制可以对抗微生物的入侵。屠宰过程使得禽类自身的防御受到破坏，肌肉组织具有丰富的营养以及高的水分活度，肉与外界环境接触也增大了微生物污染的可能性；皮毛、排泄物、淋巴结、创伤口，以及屠宰加工过程中的加工设备等环境因素都会导致冷鲜肉的微生物污染［26］。禽畜产品上的细菌与生产环境有密不可分的关系，研究表明，在肉禽产业中，嗜中温好氧菌、嗜冷菌、肠杆菌、大肠菌群、微球菌、肠球菌、热杀索丝菌、假单胞菌、乳酸菌及酵母和霉菌一般作为货架期的预测指示［27］。

汤飞等［28］对冷鲜鸡肉生产过程中车间的空气、水质、生产的机械器具、操作员工手表面和鸡产品进行了全面的微生物检测，发现这些采样点是大肠杆菌、假单胞菌以及沙门氏菌重要的污染源。梁惠［29］在冷鲜三黄鸡胸肉冷藏过程中品质变化及调控的研究发现，导致冷鲜三黄鸡肉腐败的优势腐败菌有肠杆菌、葡萄球菌、乳酸菌及假单胞菌几类，初始菌相构成中，乳酸菌和葡萄球菌各占35%、肠道杆菌占29%，冷藏末期，肠道杆菌占多数为79%、乳酸菌占18%、假单胞菌占2%；腐败菌中肠杆菌和乳酸菌为优势菌群，肠道杆菌占绝对优势。王华伟等［30］研究冰鲜鸭加工冷藏过程中的主要腐败菌来源，结果显示，因生产过程交叉污染导致产品在冷藏初期已具有一定数量的微生物，主要为乳酸菌、肠杆菌科、假单胞菌。

综合近年来对肉类微生物的研究，肉类腐败主要由特定腐败菌导致，而特定腐败菌受温度影响很大，不同温度下的特定腐败菌的生长速率不同。例如假单胞菌等是嗜冷菌，低温下依然保持很强的腐败能力；而葡萄球菌等在一定的温度区间内没有显著变化；乳酸菌的变化速率随温度改变而明显变化。根据不同细菌的特性，在不同温度条件下分离出特定腐败菌，从而建构细菌微生物预测模型，这对冷链运输行业以及冷鲜食品行业的发展具有积极的促进意义。

3 肉类微生物预测模型

20 世纪80 年代欧美国家已经开始预测肉类微生物的研究，随着计算机技术水平的不断提高，预测微生物学也不断发展。Ross 等最先提出了“微生物预报技术”这一概念，1983 年研究开发的预测腐败微生物的数据库经过10 年采用，数据准确率仍达到30%［31］。食品通常由碳水化合物、脂肪、蛋白质和水构成，能为人类提供营养物质，微生物腐败最为常见［32］。预测模型的目的是运用数学模型对微生物的产生进行定量分析，预测在一定条件下何时微生物的数量达到威胁人类健康的水平。使用预测模型对食品中微生物的生长情况进行预测，已成为食品行业的热点，预测模型应用在各种食品中。

微生物预测模型的建立是预测微生物学的核心，美国农业部Whiting 等提出的模型分类方法是目前世界各国普遍认同的分类方法，通常预测微生物模型被分为一级模型、二级模型和三级模型。

3.1 一级预测模型

微生物的生长状况可以用生长曲线进行描述，主要由延滞期、对数期、稳定期、衰亡期4个阶段组成。环境、食品营养组分、生长阶段等因素都会对微生物生长产生很大影响，微生物预测一级模型主要反映微生物生长的量随时间变化的关系。目前主要的一级模型有Monod 模型、Gompertz 模型、Logistic 模型、Baranyi and Roberts模型以及Richards 模型。表1 是典型的一级模型表达式以及含义。

一级模型的运用更适合受单一因素影响的微生物，在多因素共同作用下生长的微生物建构出来的一级模型精准度不高。Ratkowsky 等研究发现，在部分弱酸性食品中，温度变化对微生物的影响较为明显，因此可以运用线性和Logistic 模型来进行微生物预测［35］。Gibson 等［36］分别运用Gompertz 函数与Logistic 方程对猪肉中的肉毒杆菌进行模型建构，发现Gompertz 函数的精准度更高，对微生物生长速率进一步细化，使得Gompertz 模型得到广泛应用，为二级模型和三级模型的建立奠定了基础。

表1 典型的一级模型分类［33］Table 1 Typical first-level model classification

3.2 二级预测模型

一级模型中的参数受到环境因素的影响，二级模型侧重描述环境因子如何影响一级模型中的参数［37］，主要的二级模型有平方根模型、阿伦尼乌斯模型、Ratkowsky 模型、Arrhenius 模型以及响应曲面模型（表2）。在二级模型中，应用较广泛的是平方根模型以及响应曲面模型，平方根模型使用比较简单，而响应曲面模型则可以预测多种影响因素共同对微生物的抑制和灭活的影响。

Sutherland 等研究温度、pH 等环境影响因子对细菌生长的影响，并构建了针对大肠杆菌［38］、金黄色葡萄球菌［39］以及小肠结肠炎耶尔森菌［40］的二级模型。Gibson 等［41］研究温度、pH、水分活度对沙门氏菌生长的影响，并建构了相应二级模型。Bhaduri 等［42］研究在低温条件下pH、NaCl、NaNO2对小肠结肠炎耶尔森菌生长的影响，并建构了相应的二级模型。研究表明，对于一些受温度影响比较大的食品，用响应曲面模型进行微生物预测精确性更高［43］。

表2 典型的二级模型分类［34］Table 1 Typical second-level model classification

3.3 三级预测模型

三级模型综合了一级模型与二级模型［44］，使用计算机程序将一级模型和二级模型的数据转化成微生物预测软件。三级模型是一个全面的预测系统，例如数个影响因素共同作用下的微生物变化情况；不同种类微生物生长的差异与影响因素的关系；同种微生物生长情况与影响因素的关系等。在预测微生物学的发展历程中，三级模型的研究发展取得显著的成果，目前世界上开发的软件多达十几种，较为著名的预测系统有以下几种。

PMP（Pathogen Modeling Program）预测软件系统由美国农业部开发，软件包含10 种重要食源性病原菌的38 个预测模型。PMP 的优点是能通过水分活度、温度、pH 等参数预测微生物生长情况，同时可以利用自动响应模型处理大多数常用防腐剂，预测结果精准性高；其缺点是缺乏温度波动下的生长和失活模型［45］。

FM（Food Micromodel）食品微生物生物模型开发于1992 年，由英国农业、渔业和食品部基于数据库和数学模型开发。该模型可以预测描述12种食品腐败菌和致病菌的生长与环境因素之间的关系，信息量大，数学模型成熟；但由于使用的是Gompertz 模型，会导致高估微生物的生长速率。英国食品研究院在FM 的基础上进行改进，开发了Growth Predictor，该软件提高了预测病原微生物的种类，使用的是Baranyi 和Roberts 模型，具有操作简单、使用方便等优点［46］。

ComBase（Combined Database）［47］数据库模型是由英美两国整合PMP、FM 和Growth Predictor建构而成，2003 年英、美科学家在第四届国际预测食品微生物学会议上宣告其建构完成。之后该系统不断得到完善，近年来数据表明其拥有40489 个有关微生物生长和存活的数据档案，是世界上最大的预测微生物学信息数据库。ComBase系统能够预测微生物在不同环境条件下的生长情况，并且可以分析和比较不同环境下的生长情况。

SSP（Seadfood Spoilage Pridictor）预测系统由丹麦水产研究所开发，可以用来预测海洋食品在恒温或温度波动条件下海洋食品的货架期和特定腐败微生物的生长。澳大利亚Tasmannia 大学开发的FSP（Food Spoilage Predictor）［48］以及法国农业和研究局开发的SymPrevius 软件等均是预测微生物领域中的重要成果。

经过长期的发展，我国在预测微生物学领域也取得了较好的成果，例如中国水产科学院与美国联合开发了FSLP（Fish Shelf Life Predictor）［49］预测系统，以及南京农业大学肉品加工与质量控制教育部重点实验室建立了冷却猪肉微生物预测软件。

4 微生物预测模型的前景

预测微生物学是运用数学模型描述特定环境对食品中微生物生长状态的影响，从而判定食品的腐败变质程度，进而预测食品货架期的技术［50］。预测微生物学经过近半个世纪的研究已成为较为系统的学科，但仍然处于初始阶段，存在很多不足以及有待研究探索的问题。例如：建立一个完备的模型，需要庞大的数据做支撑，工作量相当庞大；产品随着销售、运输等因素而不断更换贮藏环境，环境的不确定性造成模型中的变量不能确定，导致预测结果准确率下降；微生物的培养方式较为原始，实验数据准确性不能保证等。为了尽可能解决这些问题，利用间接法获得微生物生长的数据成为目前深入研究的方法。由于微生物预测模型误差小于实验室带来的误差，因而微生物预测模型在食品检测和食品工业领域应用更加广泛［51］。但是将预测微生物学的知识应用到食品制造中仍然是个难题，是整个食品安全建模领域面临的主要挑战。为促进这一进程，Plaza-Rodríguez 等［52］结合当地政府制定了一项战略，建立一个开放的基于网络的模型建议与资源收集库，并综合了很多建立食品安全模型库的策略。这些协作模型资源可以显著地促进食品安全模型知识从研究到商业的应用转移。从环保和食品安全角度来看，采用微生物预测模型是食品行业未来的发展趋势，将成为食品加工过程规范控制、食品货架期评估以及防腐剂测评的重要工具。