大动物节段性骨缺损模型的研究进展

陈胡贵 覃建国 李理 石展英 潘浩波 李兵 崔旭

0 引言

四肢节段性骨缺损，尤其是临界尺寸节段性骨缺损的修复仍然是骨科最具挑战性的难题之一。一般认为，临界尺寸骨缺损(critical size defect，CSD)是指在其生长周期内不能凭借自身再生能力修复或者骨再生少于10% 的最小骨缺损[1]。节段性骨缺损过大，即节段性CSD的发生，会导致创面环境不良和缺损部位生物力学不稳定。若再受到代谢性疾病、激素分泌异常、手术技术不佳、体内营养不良等因素的影响，CSD往往无法自愈并易发生骨不连[2]。若得不到有效的骨移植替代治疗，患者很可能会面临截肢的结局。

目前主流的骨移植替代材料主要包括自体骨、同种异体骨，以及人工骨材料等。自体骨及同种异体骨移植虽然成骨效果确切，但各自存在诸多缺陷使其临床应用受到一定的局限[3]。此外，现有的再生治疗方案，如带蒂血管化的骨移植、Masqulet技术或Ilizarov牵张成骨技术，都有特定的适应证和明显的局限性[4-5]。因此临床对于人工骨材料的需求日益迫切，开发兼具合适力学性能和骨诱导活性的人工骨材料具有重大意义。

为有效评价人工骨材料作为骨缺损修复替代物的发展前景，加速人工骨材料的转化和扩展相关领域的应用，有必要构建可重复且有效的大动物节段性骨缺损模型。大动物节段性骨缺损模型是通过动物实验模仿人类骨缺损体内环境及骨力学特性，从而测定人工骨材料的骨诱导活性及其他生物学特性。理想的动物模型应具有以下几个特点：(1)与人骨结构相似度高；(2)建模管理可行性强；(3)来源成本低；(4)社会伦理接受度大。目前最常用于构建节段性骨缺损模型的大动物包括狗、猪、山羊、绵羊等。而最常用的固定方式则包括：支架外固定、髓内钉固定、钢板内固定。尽管众多学者都致力于该领域的研究，但目前尚无一种理想的大动物节段性骨缺损模型能完美模拟人类骨结构和力学特征。因此本文将重点介绍用于评价人工骨材料常用和有效的大动物节段性骨缺损模型的研究进展，对临界尺寸骨缺损大小的取值、常用建模动物的优缺点、节段性骨缺损模型的建立、不同固定方式等方面进行综述，以促进大动物节段性骨缺损模型的优化改进。

1 节段性CSD的特征考量

大动物节段性CSD的具体数值，取决于诸多因素，如动物的年龄和种类、物种系统发育状况、缺损解剖位置、临近软组织及生物力学条件、骨膜是否存在、固定方法、肢体机械负荷和应力等[6]。CSD动物模型被认为是评价人工植骨材料促进骨组织修复重建的标准模型。鉴于影响CSD的因素众多，常需要一个对照组来确认所评估的缺陷尺寸在研究期间不能自愈。

通过文献检索，检索到近5年内关于采用大动物节段性骨缺损模型评估人工植骨材料骨修复性能研究的文献共7篇(详见表1)。其中，绵羊在大动物节段性骨缺损修复重建实验中的使用频率最高。值得注意的是，即使使用相同的模型动物，关于CSD大小的取值也未达到共识。例如，有研究认为，绵羊节段性CSD大约是相应骨干直径的3倍[7]。但也有研究显示[8]，在平均中轴直径为22 cm的绵羊品种中，胫骨骨干5 cm结合骨膜缺损即可引起CSD。Lammens等[9]认为，基于绵羊胫骨节段性骨缺损模型研究聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)的骨缺损修复性能，4.5 cm的骨缺损比3 cm更为合适。除了在节段性CSD大小上的较大差异外，在不同研究中也选择了不同的固定方法，包括支架外固定、髓内钉固定和钢板内固定等，这些差异使得对不同研究进行比较变得困难。同时，许多研究中缺少部分重要信息(如动物年龄、种类、性别等)，导致研究结果存在歧义，甚至无法验证。模型的多样性使得比较不同研究的结果非常困难。所以，很有必要减少动物模型的可变性，并对几个描述良好、转化能力强的模型达成一致认识。

2 节段性骨缺损模型常用的大动物

不同动物物种在体型、骨骼解剖和骨骼力学性能上存在显著差异。同种实验动物的个体差异和植入部位也会对修复效果和再生速度产生较大影响[15]。尚无一种理想的大动物节段性骨缺损模型能完美模拟人类骨结构和力学特征。因此，在选择合适的动物物种时，理解其特定骨骼特征(如骨的微观结构、组成及骨重建的特点)、力学特征(如骨的载荷-变形曲线、骨截面惯状矩、骨韧度、骨强度、骨弹性以及疲劳性等特点)以及与人类临床情况的相似性和差异性，有助于研究材料与骨组织的相互作用，尤其是有助于深入探讨人工骨材料的安全性和有效性。

表1 近5年各种大动物节段性骨缺损模型研究Table 1 Study on various animal models of segmental bone defects in recent 5 years

骨骼成熟的大型动物，如狗、猪、山羊和绵羊等，是用于评估植骨材料在节段性骨缺损修复重建效果中最具临床相关性的模型动物。大型动物具有与人体类似的骨微结构、生理和生物力学特性[6]。此外，大型动物的骨骼表面和体积也相对较大，因而能更好地模拟临床常用植入物手术入路方案和内外固定装置。

2.1 犬类

一直以来，犬类就是用于研究人工植骨材料骨修复重建效果的常用大型动物。虽然在微观结构和重塑方面与人类骨组织存在一定的差异，但犬类骨组织却具有与人类骨组织相似的重量、密度、有机和无机成分等特性[16]。而且从实用角度看，犬类在长时间的研究期间相对比较容易饲养和安置。生物学上的相似性、成本和饲养方面的实用简便性，使犬科动物可用于承重部位的节段性骨缺损修复重建研究。然而，基于犬类作为宠物和处于“人类最好的朋友”的特殊地位，在医学研究中使用犬类作为实验对象时的动物福利和伦理问题逐渐凸显，因此犬科动物在骨缺损特别是节段性骨缺损的修复重建模型中的使用已经明显减少。

2.2 猪

猪也是一种常用于节段性骨缺损修复重建效果评估的大型动物。猪在骨骼解剖学、形态、愈合能力、重塑过程和矿物质密度等方面与人类的骨骼相似[17]。猪股骨的直径和截面面积与人类大致相等，骨再生速率与人类相近，还具有与人类相似的板层骨结构[18]，因而猪成为人工植骨材料体内生物安全性和骨修复性能研究的可选大型动物。但是，猪的胫骨和股骨的长度相对较小，不能应用于为人类设计的大尺寸植入物的骨修复性能评估，在选择固定装置时也会受限。再加上猪体重大、生长速度快，许多学者认为其并不适合用于人工植骨材料的骨修复性能研究。

2.3 山羊

山羊是中等大小的反刍动物。尽管山羊的骨骼结构与人类不同，且由于易受惊吓的原因，在实验中容易产生较大的接骨失败风险，难以建立术后局部负重。但因为成年山羊与成年人类体重相似，有类似的骨骼形成率、骨骼大小和生物力学等特性，其长骨尺寸也相对更加适用于人类成年个体植骨材料的植入和固定[13]，部分学者仍将山羊视为植骨材料临床前生物安全性和有效性研究中颇有价值的模型动物。

2.4 绵羊

绵羊是特别温顺的动物，绵羊的身体形态(体质量、大小)可与成年人相媲美，且长骨尺寸相似，可以使用专为成年人设计的植骨材料。与人类相比，绵羊虽然在骨重建方面存在延迟，但在骨矿物组成、骨再生率、重塑能力等方面与人类极其相似[6]。此外，绵羊后肢的生物力学负荷曲线已经得到很好的描述：绵羊后肢的负载大约是成年人正常行走状态下所受负重的一半[19]，可以更加客观地评估人工骨材料在人骨缺损修复中所体现的力学特征。Reichert等[20]建议使用平均年龄为7～9岁的绵羊来研究节段性骨缺损，因为绵羊达到这个年龄后才会发生继发性骨重建，而继发性骨重建能使绵羊的骨组织在结构上与人类更加相似。基于上述原因，越来越多的学者在节段性骨缺损模型研究中倾向于选用绵羊作为建模动物。

3 大动物节段性骨缺损模型的构建

在构建大动物节段性骨缺损研究模型之前，需认真考虑影响实验结果从骨科研究转化到临床实践的因素[6]。除前文所述，需选择与人类相似的骨骼结构、生理病理及力学特征的动物模型外，动物的年龄、缺损解剖位置、缺损大小、骨膜是否存在、骨材料固定方式、肢体机械负荷和应力等因素也需考虑在内；同时，还要注意获取实验动物的成本及社会可接受度，如动物的可得性、照顾成本以及动物实验伦理等。建立大动物骨缺损模型的步骤主要包括术前计划和准备、手术过程、术后管理等3个阶段，每个阶段对手术的成功都相当重要[21]。

3.1 术前计划和准备

术前需制定详细计划以明确植骨材料的结构和大小、模型动物的基本特征(物种、年龄、性别、体质量、数量)以及合理完善的人员配置。术前准备阶段则主要包括：禁饮禁食、预防感染、镇静镇痛、全身麻醉、麻醉评估等方面。体格较小的反刍动物建议采取气管内插管，提供安全的气道，防止唾液和胃内容物的反流及吸入性肺炎。

3.2 手术过程

外科手术建立节段性骨缺损的过程需要注意的问题及存在的困难：(1)术中要有效建立统一标准骨缺损的解剖位置；(2)考虑CSD的具体长度，同时应建立空白对照组以明确其不可自愈值；(3)手术入路要接近缺损部位且软组织和肌肉较少，能够充分暴露截骨所需要的范围，同时要避免损伤血管、神经及软组织；(4)综合考虑骨膜剥离缺损近端与远端的距离，以减少自愈的可能；(5)截骨过程中用生理盐水冲洗降温是有效防止骨坏死的关键；(6)选择合适有效的内/外固定装置。

3.3 术后管理

术后管理包括以下几个内容。(1)术后悬吊：手术后将动物进行悬吊，可以避免手术肢体负重，允许动物有一个渐进期来适应手术的肢体。(2)术后X线观察：术后需立即进行X线检查，以便发现和及时解决如接骨螺钉松动、螺钉过长、假体周围骨折等问题。(3)术后需进行充分的镇痛。(4)术后抗感染：在术后给动物提供适当的抗生素，如短效广谱抗生素，1次/d，连续3 d，并根据实际情况需要继续给药。(5)术后随访：对于大动物模型的随访时间而言，由于构建模型的方案不同，手术后对动物进行随访的时间也不尽相同，但在临床上，节段性骨缺损首次手术后12个月内极少取出内固定装置，因此，选择12个月作为时间节点是很有必要的。为缩短研究时间，也有学者选择6个月作为时间节点。选择6个月的时间点具有实际优势，同时仍然能够对骨再生进行强有力的评估，并及早评估生物力学强度[21]。

4 节段性骨缺损大动物模型常用的固定方法

影响节段性骨缺损修复重建效果的另一个重要因素就是所使用的固定方式和固定器械类型[22]。固定方式的选择不仅要能模拟临床环境，还要能提供合适的刚性来支持骨愈合，不充分和过于僵硬的固定都可能延迟骨愈合[23]。由于大多数研究使用的固定器械最初并不是专门为动物而设计的，因此尚不清楚在研究过程中固定器械是否能够有效负荷，以及固定器械是否会对临床转化产生不利影响。目前在节段性骨缺损大动物模型研究中使用的多种固定技术各有其优缺点。

4.1 支架外固定

从临床角度来看，支架外固定是一种临时固定措施，尤其适用于下肢创伤同时发生软组织缺损的情况[24]。支架外固定对软组织损伤程度较小，手术相对容易，不会妨碍植骨材料的植入，所以被视为常用的固定技术，在节段性骨缺损修复重建研究中得到运用[25-26]。但外固定支架技术容易发生钉孔感染，进而导致螺钉松动，最终出现植骨失败。此外，另一个限制外固定支架应用的重要因素就是其骨愈合所需时间通常比内固定更长[27]。

4.2 髓内钉固定

目前临床对于下肢骨干中部的骨折治疗，髓内钉内固定是最常见的方案。髓内钉是一种中心负荷载体，对外力有很高的耐受性。为了使骨髓腔能够提供足够的空间将髓内钉植入骨中，通常需要先进行扩髓。而这一过程本身会显著提高髓内的温度，髓内高温与皮质骨微循环的损伤会导致骨组织坏死及骨内膜结构和血运的改变。此外，扩髓的过程中髓内压力明显升高，可能会引起空气栓塞或脂肪栓塞及相关组织器官的梗死[28]。临床上也有非扩髓内钉，其具有产生热量少、能够保障骨内膜血运通畅等优点。但使用这些髓内钉却有很高的接骨失败率，因为其存在髓内钉直径较小，容易出现固定不牢、不愈合几率高等问题。髓内钉固定最大的缺点就是会严重影响植骨材料的骨缺损填充空间。尽管有上述许多缺陷，仍有部分关于绵羊胫骨的节段性骨缺损修复重建研究中使用了髓内钉固定技术[29]。

4.3 钢板内固定

钢板内固定是临床治疗中骨干节段性骨缺损的主要方法。钢板内固定是一种偏心载荷载体，有低到中等的植入物轴向偏移率，伴随植骨失败的风险。在钢板固定的绝对刚性应力下，骨膜有可能因骨表面压迫而受损，从而影响骨吸收或延迟愈合。但与其他固定方法对比，钢板内固定优势明显，主要体现在以下几个方面。首先，使用钢板内固定实现稳定骨折的同时，植入材料可完整填充整个缺损，这在节段性骨缺损修复重建中至关重要的。其次，钢板可以准确弯曲，使其与长骨骨干轮廓一致，易实现骨缺损部位的刚性固定。最后，胫骨骨干主要由位于胫骨近端和外侧的营养血管供应。沿胫骨前内侧放置钢板能避开这些血管，保留了残余胫骨的血液供应，有助于骨再生愈合。近年来，除标准钢板外，越来越多大动物节段性骨缺损模型的采用了动力加压钢板(dynamic compression plate，DCP)固定装置[30]。相关研究表明，DCP能促进周围骨痂的早期形成，显示出比标准钢板更强更快的骨愈合能力[31]。因此，DCP应是大动物节段性骨缺损修复模型首选的固定装置之一。

5 总结与展望

大动物节段性骨缺损模型的构建，有利于对人工骨材料的骨诱导活性及其他生物学特性进行长期观察和深入研究，获得更加接近临床实际的证据，从而加速人工骨材料的转化和扩展相关领域的应用。目前模型的多样性使得比较不同研究的结果非常困难，不利于人工骨材料的科学评价。如何构建规范的大动物节段性骨缺损模型标准将会是备受关注的研究方向。本文对临界尺寸骨缺损大小取值、常用建模动物的优缺点、节段性骨缺损模型的建立、骨材料的不同固定方法等方面进行详细介绍，有助于研究者对大动物节段性骨缺损模型的全面认识，为进一步研究提供了方法与思路。