N-乙酰半胱氨酸对PM2.5致支气管上皮细胞损伤的保护作用体外实验

郭 淼，闫 鹏，韩国鑫，朱 明，金 珊，肖 坤，解立新

1 解放军医学院，北京 100853；2 解放军总医院 呼吸与危重症医学部，北京 100853；3 战略支援部队特色医学中心 急诊科，北京 100101；4 美中宜和妇儿医院 内科，北京 100101

可吸入颗粒物PM2.5对人体健康的影响受到全世界的广泛关注。近年来的相关研究表明，PM2.5会加重慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)等肺疾。PM2.5被吸入后沉积于呼吸道上皮，进入细胞间空隙，促使生成白细胞介素(interleukin，IL)-1β、IL-6、肿瘤坏死因子等多种促炎性细胞因子，这些分子在短时间内释放，促进呼吸系统的炎症反应，从而加重患者的呼吸道症状，对呼吸系统造成不利影响[1-2]。因此有效控制炎症反应，可以减轻PM2.5引起的呼吸系统功能障碍。N-乙酰半胱氨酸(N-acetyl-Lcysteine，NAC)是一种黏液溶解剂。相关研究发现NAC拥有较强的抗氧化作用，能够有效减轻粉尘颗粒引起的气道上皮细胞炎症反应[3]。自噬作为COPD的发病机制之一，可以影响气道黏液的分泌和气道重构，但其是促进COPD的发展还是作为一种防御机制国内外仍然存在争议[4-5]。在PM2.5诱导的气道反应中，自噬的作用，以及如何抑制自噬的作用以达到缓解气道炎症反应，相关研究较少。近期的研究表明，NAC可以通过调节自噬，减轻氧化应激诱导的细胞损伤和衰老[6-7]。这为我们研究如何通过调控自噬，以达到抑制PM2.5诱导的气道炎症反应提供了新思路。本研究拟通过探讨NAC对PM2.5致人支气管上皮细胞凋亡和自噬反应的抑制作用，以期寻找新的方法来减弱PM2.5的肺毒性。

材料与方法

1 试剂和仪器 BEAS-2B细胞(上海斯信生物科技有限公司)，RPMI Medium 1 640培养基(Gibco)，胎牛血清(Gibco)，Penicillin-Streptomycin Solution(HyClone)，L-Glutamine、Sodium Pyruvate (Gibco)，N-乙酰半胱氨酸(Sigma)，LC3b抗体、P62抗体(CST)，4%多聚甲醛(碧云天)，Triton X-100(上海西唐生物科技有限公司)，牛血清白蛋白溶液(Sigma)，Alexa Fluor 488标记山羊抗兔IgG(碧云天)，GAPDH (14C10) Rabbit mAb(CST)，Immobilon Western HRP底物化学发光液(默克密理博)，CO2培养箱(Thermoscientific)，流式细胞仪(BD FACSCalibur)，激光共聚焦显微镜 TCS-SP8(双光子、FLIM；Leica徕卡)，Sage creation化学发光凝胶 成像仪(北京赛智创业科技有限公司)。

2 雾霾颗粒的收集 依据中华人民共和国国家环境保护标准(HJ 92-2013)所述要求，选择距离地面约20 m的露天平台，使用型号为2025i型环境空气颗粒物(PM2.5)采样器[质(认)字No.2014-098，赛默飞世尔科技(中国)有限公司]，当空气质量指数(AQI)＞200 m3/L时，采集PM2.5标本。选择200 mm×250 mm高纯度玻璃纤维膜(无胶黏剂)作为滤膜，连续采集24 h。在采集结束后，使用镊子小心取下滤膜，在确认滤膜无破裂后，将滤膜的采样面向里对折。在此过程中注意保持滤面平整，避免颗粒物脱落，以铝箔包裹后放入密封袋中，然后放置于冰盒中带入实验室，在-20℃下 保存备用。

3 PM2.5颗粒的洗脱和配制 使用无菌手术剪把采集好的PM2.5滤膜剪成约1 cm2大小，置于装有适量灭菌超纯水的洁净烧杯里，以保鲜膜封口后超声振荡，选择功率为500 W，工作频率40 kHz，超声时间为15 min×3次，超声过程中加冰使水温保持在25 ℃以下。收集洗脱液，用6 ～ 8层无菌纱布滤过，滤出液-80 ℃冷冻下过夜，真空冷干燥成干粉，置于密闭的玻璃容器中，-80℃冰箱保存。称取适量的PM2.5干粉，经紫外线照射30 min，在超净台中加入PBS溶液，配制成终浓度为100 mg/mL的PM2.5颗粒母液，充分混匀后置 于4℃冰箱保存。

4 细胞培养 将BEAS-2B细胞置于含10%胎牛血清、1% L-Glutamine、1% Sodium Pyruvate、1%Penicillin-Streptomycin Solution、87% RPMI Medium 1640培养基中，于 37 ℃、5% CO2条件下培养，每 天换培养基，隔天按 1∶2的比例传代。

5 实验分组 选取对数生长期的细胞制成单细胞悬液，接种于6孔板中，培养24 h待细胞贴壁。将实验细胞按照不同暴露因素设为控制对照组、PM2.5组、PM2.5+NAC组。对照组为普通培养基处理16 h；PM2.5组用普通培养基预处理4 h后再用含有PM2.5的培养基处理12 h；PM2.5+NAC组用含有NAC的培养基预处理4 h再用含有PM2.5的培养基处理12 h。处理浓度为PM2.5：100 µg/mL，NAC：1 mmol/L，每组设2个复孔。处理浓度及时 间综合国内外相关研究后设定[8-10]。

6 细胞凋亡检测 收集细胞后，取ANNEXIN VFITC/PI凋亡检测试剂盒包装中的Binding Buffer稀释至1×后重悬细胞，加入Annexin V-FITC轻柔混匀后，在室温、避光环境下放置10 min，再加入PI，在室温、避光环境下孵育5 min。加入磷酸盐缓冲液(PBS)轻柔混匀，在1 h内使用流式细胞仪 进行检测。

7 共聚焦显微镜检测细胞自噬 收集、接种细胞，洗涤培养基，4%多聚甲醛孵育10 min，然后用0.5% Triton X-100孵育5 min，加入1%牛血清白蛋白处理1 h，再予LC3b抗体在4℃孵育16 h。然后用Alexa Fluor 488标记山羊抗兔IgG在室温下避光标记0.5 h，染色，使用抗淬灭的封片剂进行封片，使用共聚焦显微镜捕捉荧光图像，并进行 图像分析。

8 免疫印迹杂交(Western blot) 细胞总蛋白样品制备，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，使用硝酸纤维素膜(NC膜)转膜，放置在LC3b抗体、P62抗体和GAPDH (14C10) Rabbit mAb等一抗稀释液4℃环境下孵育过夜。然后在Alexa Fluor 488标记山羊抗兔IgG的二抗稀释液中，常温环境下孵育1 h。在Immobilon Western HRP底物化学发光液中，室温下孵育3 min。使用Sage creation化学发光凝胶成像仪进行曝光，处理图像后 ，进行分析。

9 统计学分析 所有资料采用IBM SPSS Statistics 24软件进行统计学分析。计量资料符合正态分布，以 x¯±s 表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD检验。P＜0.05为差异有统 计学意义。

结 果

1 三组支气管上皮细胞凋亡率比较 与对照组和PM2.5+NAC组比较，PM2.5组细胞凋亡明显增加(P均＜0.05)，而PM2.5+NAC组可明显抑制PM2.5(100 µg/mL)引起BEAS-2B细胞凋亡(P=0.001)。见 图1。

2 三组支气管上皮细胞自噬比较 与对照组比较，PM2.5组LC3荧光量明显增加；与PM2.5组比较，PM2.5 + NAC组LC3荧光量明显减少。结果说明，PM2.5可以引起支气管上皮自噬的明显增加，而NAC可以明显抑制PM2.5引起的支气管上 皮细胞自噬 。见图2A，图2B。

3 Western Blot结 果 比 较 与 对 照 组 比 较，PM2.5组LC3Ⅱ/LC3Ⅰ明显增加，P62明显减少；与PM2.5组比较，PM2.5+NAC组LC3Ⅱ/LC3Ⅰ明显减少，P62明显增加。结果表明，NAC可以明显抑制PM2.5引起的支气管上皮细胞自噬。见 图3。

图 1 流式细胞仪测定细胞凋亡及定量分析 (aP＜0.05，vs PM2.5+NAC；bP＜0.05，vs PM2.5F ig.1 Flow cytometry. Results of apoptosis and quantification analysis (aP＜0.05, vs PM2.5+NAC; bP＜0.05, vs PM2.5

讨 论

慢性呼吸系统炎症是由于呼吸道持续暴露于空气中的微粒(包括PM2.5、香烟烟雾等污染物以及病原体)引起。作为对这些刺激的反应，肺采取许多防御机制，包括上皮屏障、先天及后天免疫。肺上皮是阻止颗粒物进入的主要屏障，因此气道上皮细胞也是吸入有害颗粒物的主要目标。在体外实验中培养支气管上皮细胞，并以各种类型的环境和实验室粒子处理细胞，已成为普遍接受的毒理学研究方法。研究表明，细颗粒物中的碳元素、过渡金属及有机成分等，可通过氧化损伤等机制诱导人支气管上皮细胞的毒性损伤[11]。香烟烟雾颗粒可通过氧化反应诱导人支气管上皮细胞BEAS-2B细胞凋亡，而NAC可抑制香烟烟雾颗粒诱导的BEAS-2B细胞凋亡[12]。相关研究支持氧化应激是PM2.5诱导的炎症反应、细胞毒性和癌变的重要机制这一观点[13]。PM2.5刺激肺上皮A549细胞后，导致其发生氧化应激损伤和自噬激活，从而损害肺功能。

本研究中，以PM2.5刺激支气管上皮细胞模拟患者的慢性炎症和上皮功能受损。结果显示，NAC可显著减少炎症刺激条件下支气管上皮细胞的凋亡，并起到保护作用。NAC的抗氧化应激作用已经非常明确，其进入细胞后产生半胱氨酸，进一步促进细胞内谷胱甘肽的产生。谷胱甘肽是半胱氨酸残基形式的活性巯基的载体，通过与活性氧/活性氮和亲电试剂相互作用，作为各种酶的辅助因子发挥抗氧化作用，清除体内氧自由基和细胞毒性物质，从而减少有害物质对亲核生物大分子的损伤[14]。而相关的临床实验和Meta分析也表明，NAC能够预防COPD的加重[15]。

图 2 细胞自噬荧光图A：细胞核的DAPI染色(蓝色)、细胞骨架的鬼笔环肽染色(红色)作为背景染色，LC3荧光呈绿色；B：荧光定量分析(aP＜0.05，vs PM2.5；bP＜0.05，vs PM2.5+NAC)Fig.2 Measurement of autophagy by fluorescent microscopy A: DAPI staining of nuclei (blue) and Phalloidin staining of cytoskeleton (red) were set as the background stain, and LC3 fluorescence was green; B: Quantification analysis (aP＜0.05, vs PM2.5; bP＜0.05, vs PM2.5+NAC)

图 3 LC3Ⅰ、LC3Ⅱ、P62、GAPDH定量分析(A。aP＜0.05，vs PM2.5；bP＜0.05，vs PM2.5+NAC)及化学发光结果(B)F ig.3 Quantification analysis (A. aP＜0.05, vs PM2.5; bP＜0.05, vs PM2.5+NAC) and chemiluminescence. Results of LC3Ⅰ, LC3Ⅱ, P62 (B)

有研究表明，自噬在肺的炎症反应中起着至关重要的作用，对慢性肺部疾病的感染有较大影响[5,16-18]。自噬包括两种主要类型：1)典型的自噬，是对细胞应力和(或)营养剥夺的一种稳态反应；2)非典型自噬(也被称为特定自噬，包括线粒体自噬/异体自噬等)，可以控制和抑制慢性炎症[19]。在COPD发生发展过程中，有长期的炎症和刺激，自噬作用更复杂。PM2.5暴露介导人支气管上皮细胞BEAS-2B细胞自噬，可以促进细胞的炎症反应，从而引起细胞的死亡。LC3是自噬标志物。在自噬过程中，LC3前体裂解形成胞质形式LC3Ⅰ，然后转化生成脂质化形式的LC3，即LC3Ⅱ。LC3Ⅱ可以附着于自噬体的膜上，是自噬体的结构蛋白。P62是自噬蛋白。在自噬过程中，P62与泛素化的蛋白质结合，再与定位于自噬小体内膜上的LC3Ⅱ形成复合物，然后在自噬溶酶体内降解。在自噬增强时，细胞质中的P62不断被降解；自噬减弱时，P62会在细胞质中不断累积。因此，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ增加，P62减少，提示自噬增强；LC3Ⅱ/LC3Ⅰ减少，P62增加，提示自噬减弱。本研究表明，PM2.5暴露可以引起人支气管上皮细胞BEAS-2B自噬的增强，而NAC可以抑制PM2.5介导的人支气管上皮细胞BEAS-2B的自噬。

本研究证明，可吸入颗粒物PM2.5可通过诱导人支气管上皮细胞BEAS-2B的凋亡和自噬，致细胞损伤；NAC可通过调控人支气管上皮细胞BEAS-2B的凋亡和自噬，减轻细胞损伤。对自噬途径的选择性操控，是调节免疫和抑制慢性阻塞性肺病慢性炎症的一种新思路[20]。