产前筛查结果与不良妊娠结局关系分析

王红坤，赵燕玲，陶 炯，徐先明

(上海交通大学附属上海市第一人民医院产前诊断中心，上海 201620)

产前筛查是指用简便、经济、可行、无创的检查方法，筛选出胎儿患染色体疾病[(如唐氏综合征(Down syndrome,DS)]或先天性结构畸形[(如开放性神经管缺陷(neural tube defects,NTD)]等的高风险人群，是避免出生缺陷的重要手段。临床上最常用的产前筛查主要有血清学唐氏综合征筛查和孕妇外周血胎儿游离DNA产前筛查(non-invasive prenatal testing，NIPT)。近年研究发现，除了筛查出胎儿染色体异常和开放性神经管畸形的人群以外[1-2]，血清学唐氏综合征筛查极高风险、假阳性、血清标记物的中位数倍数值(Multiple of Median，MoM值)异常以及NIPT检测时游离胎儿DNA(cell-free fetal DNA,cffDNA)浓度或占比偏高、偏低的孕妇发生子痫前期、妊娠期糖尿病(gestational diabetes，GDM)、自然流产、早产、死胎/死产/新生儿死亡、胎儿宫内发育不良、前置胎盘、胎盘早剥等不良妊娠结局的概率增加[2-8]。本研究通过回顾分析中孕血清学唐氏筛查和NIPT的不同风险结果以及cffDNA占比的极端值与不良妊娠结局的关系，为临床上拓宽产前筛查不同结果的意义提供实践依据。

1 资料与方法

1.1 研究对象 选取2017年2月1日至2019年6月1日在上海市第一人民医院产前诊断中心接受中孕期血清学唐氏筛查或NIPT，并在本院分娩，可随访到妊娠结局的孕妇。筛查孕周：中孕期血清学唐氏筛查为孕15～20+6周；NIPT为孕12～26+6周。纳入标准：汉族、单胎、孕前无内外科合并症。排除标准：非汉族；多胎妊娠；孕前有内外科慢性疾病；超声提示胎儿结构异常；有基因遗传病家族史或提示胎儿罹患基因病高风险；夫妇一方有明确染色体异常；失访者。此外，NIPT排除标准还有:1年内接受过异体输血、移植手术、异体细胞治疗等；孕期合并恶性肿瘤。

1.2 研究方法

1.2.1 血清学唐氏筛查检测 使用AutoDELFIA 1235时间分辨荧光免疫检测系统(美国Perkin ElmerTM)测定孕妇血清学指标甲胎蛋白(alphafetoprotein，AFP)、游离β-人绒毛促性腺激素(human chorionic gonadotropin，HCG)、游离雌三醇(unconjugated estriol，uE3)、抑制素A(Inhibin A)的水平，AFP/游离β-HCG双标记试剂盒、uE3试剂盒由美国Perkin Elmer公司提供，抑制素A由广州丰华生物工程有限公司提供。以超声测定胎儿双顶径作为计算孕周的依据，将孕妇年龄、胎龄等信息以及检测数值导入风险计算软件Lifecycle 4.0(Perkin ElmerTM，美国)，转换标记物浓度为MOM值，并计算DS和18-三体综合征(Trisomy 18，T18)风险值。风险值≥1/270为DS高风险，风险值≥1/350为T18高风险，介于高风险切割值与1/1000之间为中风险。AFP≥2.5MoM为NTD高风险。

1.2.2 NIPT检测 采集孕妇外周血10ml，用两步离心法分离血浆，使用北京贝瑞和康胎儿非整倍体检测试剂盒(可逆末终止测序法)提取胎儿游离DNA以及文库构建。经罗氏480荧光定量PCR仪对文库进行定量后，经illumina NexSeq CN500平台进行第二代高通量测序，通过生物信息分析，得到各染色体的Z值。21，18，13三条染色体，Z值绝对值≥3，提示异常。除上述3条以外的其他常染色体，Z值绝对值≥5，提示异常。女性胎儿X染色体，Z值绝对值≥4，提示异常。男性胎儿性染色体要综合参考X染色体和Y染色体的Z值进行分析[9]。

1.2.3 计算cffDNA占比的方法 挑选男胎样本作为训练集，通过比对到Y染色体的方法计算得到cffDNA在母血总游离DNA中的占比(cffDNA/总游离DNA*100%=cffDNA%)。根据以下公式计算大小比例(size ratio,SR):SR=P(100-150)/P(163-169)，其中，P(100-150)是指长度为100～150bp片段的百分比，P(163-169)是指长度为163～169bp片段的百分比。根据训练集每个样本的片段分布结果与cffDNA%，用最小二乘法一次线性函数拟合，即SR=a+b*cffDNA%，其中a是截距，b是斜率。其中拟合参数截距0.7890，斜率0.0328，相关系数R=0.768。根据以上拟合得到的参数可用于计算cffDNA占比，即cffDNA%=(SR-a)/b。

1.2.4 cffDNA占比过高或过低 cffDNA%≥95th百分位，数值≥20.0%，定为cffDNA%偏高;cffDNA%≤5th百分位，数值≤5.82%，定为cffDNA%偏低。cffDNA%适中组：5th百分位

1.3 随访妊娠结局 通过查阅门诊和住院病历以及电话随访，获得妊娠结局。如2020年3月1日前没有随访到妊娠结局视为失访。各种不良妊娠结局的诊断标准参考《妇产科学》第9版[10]，包括GDM、妊娠期高血压疾病(hypertensive disorder of pregnancy，HDP)、流产、早产、死胎、羊水过多、羊水过少、前置胎盘、胎盘早剥,新生儿窒息及新生儿死亡等。

2 结 果

2.1 血清学唐氏筛查孕妇基本特征 于中孕期行血清学唐氏筛查的孕妇共2483例，其中DS高风险181例、T18高风险16例、NTD高风险19例；DS中风险320例、T18中风险17例；DS、T18、NTD均为低风险的孕妇1930例。NTD高风险组平均预产期年龄为(26.6±3.0)岁，明显低于其他各组(P<0.01)。DS高风险组合并胰岛素依赖型糖尿病者占2.21%，高于低风险组(0.26%)(P<0.01)。各组的采样孕周、体重及受孕方式均无统计学差异。见表1。

表1 血清学唐氏筛查孕妇基本特征

2.2 血清学唐氏筛查不同风险情况妊娠结局的差异 DS中风险组和T18中风险组发生各种不良妊娠结局的概率与低风险组孕妇均无明显差异。DS高风险组的妊娠期糖尿病发生率为14.92%，远高于低风险组(9.95%)(P=0.032);前置胎盘发生率为2.76%，高于低风险组(0.66%)(P=0.012)。T18高风险组胎儿染色体病发生率(6.25%)高于低风险组(0.15%)(P=0.024)。NTD高风险组早产发生率(21.05%)显著高于低风险组(4.67%)(P=0.010)，自然流产率(10.53%)远高于低风险组(1.02%)(P=0.015)，死胎/死产/新生儿死亡率(10.53%)明显高于低风险组(0.3%)(P=0.001)。NTD组发生任一种妊娠并发症和胎儿/新生儿异常的概率(47.37%和15.79%)均远高于其他各组(P<0.01和P=0.032)。各组发生胎儿附属物异常的概率均无差异。见表2～4。

表2 血清学唐氏筛查各组妊娠结局(妊娠并发症)比较[n(%)]

表3 血清学唐氏筛查各组妊娠结局(胎儿/新生儿异常)比较[n(%)]

表4 血清学唐氏筛查各组妊娠结局(胎儿附属物异常)比较[n(%)]

2.3 NIPT组孕妇基本特征 2322例行NIPT的孕妇中，高风险(包括常染色体三体，性染色体单体和三体，以及微缺失/微重复综合征的高风险)共88例，低风险共2234例，其中cffDNA%偏低组106例，cffDNA%适中组2019例，cffDNA%偏高组109例。cffDNA%偏高组采样孕周[(17.42±3.46)周]较其他三组大。cffDNA%偏低组年龄[(31.21±4.04)岁]和高风险组年龄[(31.57±4.60)岁]略高于其他两组[(30.26±4.33)岁，(30.11±4.19)岁]。4组的BMI、受孕方式、既往不良孕产史差异无统计学意义。见表5。

表5 NIPT各组基本特征

2.4 NIPT高风险及cffDNA%偏低和cffDNA%偏低组偏高发生不良妊娠结局的比较 cffDNA%偏低组发生妊娠并发症的概率最高，发生其中一种者占30.19%，同时出现两种及以上者6.6%，其次为NIPT高风险组，出现一种妊娠并发症者有21.59%，出现两种及以上为4.55%，均高于cffDNA%适中组和偏高组(P<0.01)。NIPT高风险组和cffDNA%偏低组发生妊娠期高血压疾病的概率(9.09%和8.49%)高于cffDNA%适中组和偏高组(2.63%和0%)(P<0.01)，发生妊娠期糖尿病的概率(12.5%和16.98%)也明显高于其他两组(8.62%和7.34%)(P=0.017)。cffDNA%偏低组自然流产发生率为8.49%，明显高于其他三组(P<0.01)。NIPT高风险组没有出现胎儿/新生儿合并症的仅有51.14%，远低于其他三组(P<0.01)，发生染色体异常者为40.91%、胎儿畸形为9.09%、新生儿疾病为13.64%，显著高于其他三组(P均<0.01)。四组发生胎儿附属物异常的概率无差异。见表6。

表6 NIPT各组妊娠结局比较[n(%)]

3 讨 论

多年来，血清学唐氏筛查在全球范围内被广泛用于产前筛查胎儿DS、T18、NTD的高风险人群。血清学唐氏筛查阳性的人群，除了DS、T18和NTD外，还易出现其他染色体异常如13-三体综合征[11]和各种先天性结构畸形[12]，而且患子痫前期、前置胎盘、胎盘早剥、妊娠丢失、早产、低出生体重儿、死胎、新生儿死亡等不良妊娠结局的概率增加[3，11-12]。

血清学唐氏筛查生化标记物AFP、β-HCG、uE3等主要由胎盘和(或)胎儿参与合成，它们在血清中的水平可以反映胎盘功能以及胎儿宫内发育情况，因此对存在胎儿和胎盘生理功能改变的不良妊娠结局均有预测作用。HCG由胎盘合体滋养层细胞分泌，胎盘灌注不良、胎盘发育不全等病理状态可导致滋养细胞反应性增生，进而导致HCG分泌量改变，母亲血清中HCG也随之改变。孕妇血清β-HCG水平过高或过低与胎儿宫内发育迟缓、早产、自然流产、低出生体重儿、GDM等发生相关[13]。uE3合成前体大部分来自胎儿，借助胎儿肝脏和肾上腺中的酶，最终在胎盘完成合成。胎盘功能受损缺血缺氧，可致血管内皮细胞损伤，并释放化学因子，诱导滋养细胞凋亡，uE3合成减少，血清uE3降低。孕妇血清低uE3时胎儿宫内生长受限和低出生体重儿发生风险增加[14]。AFP早期产生于卵黄囊，晚期来自于胎儿肝脏和胃肠道，少量AFP穿过胎盘，可在母体血清中测定。胎儿缺陷如NTD等可导致羊水中AFP浓度增加以及胎盘损伤引起从胎儿到母体的循环转移增加均可导致母亲血清AFP增加。AFP升高的妇女中除了胎儿神经管缺陷外，发生子痫前期、小于胎龄儿、死产/新生儿死亡的概率均增加[5]。

当胎儿为DS时，母亲血清β-HCG升高，而在胎儿为T18时降低；胎儿为DS或T18时母亲血清学AFP、uE3均降低；胎儿发生NTD时，孕妇血清AFP升高[15]。Baer等[3]将9051例血清学唐氏综合征高风险孕妇的妊娠结局与30928例低风险孕妇比较，发现高风险组子痫前期、前置胎盘、胎盘早剥以及小于20周的胎儿丢失均高于低风险组；两项及以上高风险的孕妇，出现胎儿和新生儿死亡的概率会增加。有研究发现，DS血清学筛查结果为极高风险(风险值≥1/20)者出现胎儿染色体异常、胎儿超声结构异常、自然流产、死胎和早产的概率均高于普通高风险孕妇(1/20>风险值≥1/270)[2]。NTD高风险的截断值是AFP≥2.5MoM，而Allen等[5]研究中，当AFP>2.0MoM时，发生子痫前期、小于胎龄儿、死产/新生儿死亡风险就明显增大。

本研究发现，血清学唐氏筛查的阳性预测值(positive predictive value,PPV)并不高，216例高风险中，只有1例T18高风险为真阳性。此外，高风险孕妇发生不良母胎结局的概率大大增加，如：DS高风险组妊娠期糖尿病和前置胎盘发生率远高于低风险组；NTD高风险组发生任一种妊娠并发症的概率可高达47.37%，发生任一胎儿/新生儿异常的概率也有15.79%，均远高于低风险组；早产率、自然流产率、死胎/死产/新生儿死亡率与低风险组相比都是增加的。因此，血清学唐氏筛查高风险人群，尤其是NTD高风险，即便是假阳性，都应密切注意各项产检指标，加强孕期健康指导，降低不良妊娠结局的发生率。

与传统的血清学唐氏筛查相比较，NIPT具有更高的PPV，目前在临床得到越来越多的应用。除了DS、T18和13-三体综合征外，NIPT还可用于筛查其他常染色体和性染色体非整倍体以及微缺失/微重复综合征[1]。在妊娠期间，胎盘细胞滋养细胞和合胞滋养细胞经历了融合和凋亡的生理周期，DNA片段从胎盘释放到母体循环中。NIPT是对含有母体和胎盘的游离DNA片段的母体血浆样本进行测序和生物信息分析。胎盘与总(由母体和胎盘组成)游离DNA比率称为胎儿分数(fetal fraction of cell-free DNA,cffDNA%)[16]。妊娠相关的病理状态可导致孕妇外周血总的游离DNA和胎儿游离DNA水平变化，cffDNA%亦可反映胎盘功能和体积。如在早发性子痫前期患者中，外周血总的游离DNA和胎儿游离DNA浓度增加，cffDNA%降低[17]。这可能是由于胎盘局部缺血引发滋养细胞凋亡加速、血管和终末器官损伤导致炎症因子释放、胎盘功能障碍时母体循环中游离DNA的清除率降低等。胎儿游离DNA能否成为一种新的生物标记物来预测子痫前期等不良妊娠结局将成为研究的新方向。Rolnik等[6]研究发现，cffDNA%越低，晚孕期发生子痫前期和胎儿生长受限的风险越大。日本一项关于5582例NIPT低风险孕妇的多中心研究发现，孕晚期出现妊娠期高血压疾病的孕妇在孕早期进行NIPT检测时的cffDNA%偏低[7]。在一项NIPT检测失败率为1.1%的研究中，发现因cffDNA过低而致NIPT检测失败的孕妇晚期流产、染色体异常、先兆子痫和妊娠期糖尿病的发生率都显著增加[8]。

本研究显示，cffDNA%偏低组最易发生妊娠并发症，其次是NIPT高风险组，这两组发生妊娠期高血压疾病和GDM的概率均明显高于cffDNA%适中组和偏高组。此外，cffDNA%偏低组孕妇还易出现自然流产。而NIPT高风险组胎儿/新生儿结局最差，真阳性36例(占40.91%)，其中29例选择引产，7例(均为性染色体异常)决定继续妊娠。除去引产的孕妇外，该组发生胎儿畸形和各种新生儿疾病的概率显著高于其他三组。因此，NIPT高风险人群孕期除应重点排除染色体疾病和胎儿畸形以外，还需监测和预防妊娠期高血压疾病和GDM，胎儿娩出后应注意是否会出现新生儿窒息等疾病。NIPT低风险当cffDNA%≤5.82%时需要关注是否出现HDP、GDM和自然流产等妊娠并发症。

综上所述，除了目标疾病以外，产前筛查还可对妊娠并发症和胎儿/新生儿不良结局做出评估。本研究样本量偏少，但也得出了相对可靠和有意义的结论，可为临床有针对性地监测和预防不良妊娠结局的发生提供一定依据。后续我们仍会继续研究，并把血清学唐筛筛查和NIPT两者结合，以期获得更好的预测效果。