水稻LEA_2家族的鉴定与表达谱分析

薛亚莉，魏晓双，周海连，李朝阳，胡利华，王令强,，张翠翠

1.华中农业大学植物科学技术学院，武汉 430070；2.亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室，南宁 530004；3.广西大学生命科学与技术学院，南宁 530004；4.广西大学农学院，南宁 530004；5.广西甘蔗生物学重点实验室，南宁 530004

到2050年，世界人口将从目前的73亿增加到预计的97亿，粮食需求也将增长59%至98%[1]。水稻(OryzasativaL.)是主要粮食作物之一，发掘水稻抗逆基因，培育高抗水稻品种，对解决粮食安全问题意义重大。

胚胎发育晚期丰富(late embryogenesis abundant proteins,LEA)蛋白参与抵御非生物逆境胁迫[2]，1981年首次在棉花子叶中发现[3]，随后在其他植物、动物和微生物中均有发现[4]。LEA蛋白最初被发现在种子脱水成熟过程中大量表达积累[5]，进一步的研究表明，植物在遭受干旱、低温、脱落酸(abscisic acid,ABA)处理、高盐等逆境胁迫后，LEA蛋白在植物不同的组织部位都可能大量表达[6]。

LEA蛋白在非生物逆境胁迫中发挥作用。在拟南芥中，过表达小麦LEA基因DHN-5可显著提高植株对渗透胁迫的耐受性[7]。将大麦LEA蛋白基因HVA7导入水稻，转基因水稻株系对干旱和盐分的耐受性显著增强[8]。在草莓中过表达小麦的LEA基因(WCOR410)可显著提高叶片的抗寒性[9]。LEA基因的异源表达不仅可以增加高等植物的胁迫耐受性，对真菌及原核生物同样有效。在酵母中过表达水稻的LEA基因OsLEA3-2，提高了其对盐胁迫和渗透胁迫的耐性[10]。葡萄固氮菌lea1基因的突变使细胞对高温、渗透胁迫更敏感[11]。将8个具有代表性的中国春小麦的TaLEAs基因导入大肠杆菌和酵母中，增强了大肠杆菌和酵母对盐和热的耐受性[12]。

植物LEA蛋白在PFAM数据库(protein families database)中根据8个PFAM号(PF03760、PF03168、PF03242、PF02987、PF00477、PF00257、PF04927和PF10714)分为8个家族，分别是LEA_1～LEA_6、Dehydrin 和SMP。2007年，Wang等[13]从水稻中鉴定出34个LEA家族成员，其中OsLEA5～OsLEA8属于LEA_2亚家族。含有LEA_2(PF03168)结构域的蛋白是植物体内鉴定出的最多一类LEA蛋白，且大多数属于疏水性蛋白[14]。本研究利用粳稻品种日本晴的基因组序列、籼稻品种明恢63的全生育期基因表达芯片、日本晴抽穗期的部分组织样品以及不同株龄的日本晴植株在干旱等多种逆境处理后的转录组测序数据或基因表达谱芯片数据，结合生物信息学分析和实时荧光定量PCR，对水稻LEA_2家族成员(OsLEA2)进行全基因组鉴定，并对其染色体分布、理化性质、系统进化及保守基序、基因结构及基因表达模式等进行分析，着重分析干旱处理、冷处理和淹水处理的日本晴水稻植株中部分OsLEA2基因的表达，旨在为进一步研究水稻LEA_2家族成员的功能提供参考，同时为水稻抗干旱育种提供候选基因。

1 材料与方法

1.1 水稻LEA_2家族成员的鉴定、染色体定位和蛋白的理化性质分析

拟南芥、小麦和水稻的全基因组数据分别从TAIR网站(https://www.arabidopsis.org/)、Ensembl网站(http://plants.ensembl.org/index.html)和TIGR网站(http://rice.plantbiology.msu.edu/)下载。从Pfam数据库网站(http://Pfam.xfam.org)检索得到水稻LEA_2基因家族的PFAM号(PF03168)，利用TBtools[15]上的HMM Search检索(e<0.001)，得到水稻LEA_2蛋白候选序列。根据文献报道的3个拟南芥AtLEA_2基因家族蛋白序列[16]和159个小麦TaLEA_2基因家族蛋白序列[17]，利用TBtools查找同源序列，得到候选序列。基于HMM Search和Blast的结果，将候选序列合并去重复后，利用在线网站Pfam (http://Pfam.xfam.org/search)对全部候选蛋白序列进行结构域搜索确认，存在LEA_2结构域的蛋白序列被认为是OsLEA_2家族成员。

从TIGR网站下载水稻全基因组蛋白序列、水稻染色体组相关信息。利用TBtools进行水稻LEA_2家族成员的染色体定位，同时运用在线网站 ExPASy (http://web.expasy.org)进行分子质量、等电点和亲水性(grand average of hydropathicity,GRAVY)预测。

1.2 水稻LEA_2家族成员的进化树构建、基序分布、基因结构和启动子区顺式作用元件分析

从TIGR网站下载水稻全基因组序列、全基因组蛋白序列、基因组结构相关信息。用TBtools提取60条LEA_2蛋白序列进行Clustalw算法比对，使用MEGA7.0软件，采用邻接法(neighbor-joining,NJ) 构建系统进化树，设置重复值为1 000；使用MEME (http://meme-suite.org/tools/meme)进行蛋白质保守基序分析，搜索的基序数设置为10，基序长度设置为6～25，其他参数为默认参数；利用TBtools绘制水稻LEA_2基因结构图谱，并选取起始密码子ATG上游2 kb的DNA序列，利用PlantCARE (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plant care/html/)进行顺式作用元件预测。

1.3 水稻LEA_2家族成员不同生育期组织表达模式分析

从CREP数据库(http://crep.ncpgr.cn/crep-cgi/home.pl)下载51个水稻LEA_2基因的表达芯片数据，选择明恢63的24个不同生育时期的平均信号值取10的对数后用于聚类分析，M1 ～ M24表示明恢63的24个不同生育时期，并使用TBtools软件的HeatMap可视化。用NCBI Primer-BLAST设计特异性引物(表1)，实时荧光定量qPCR检测部分LEA_2基因在水稻抽穗期不同组织部位的表达情况。取粳稻品种日本晴抽穗期的根、茎、穗，每个样品由4个单株混合。使用植物总RNA提取试剂盒提取水稻RNA后通过反转录试剂盒获得水稻cDNA。qPCR试剂盒使用SYBRGreen qPCR Mix，20 μL反应体系：10 μL 2×SYBR qPCR Mix，上下游引物各1 μL，8 μL稀释的cDNA。反应条件：94 ℃预变性3 min，94 ℃变性15 s，56.5 ℃退火15 s，72 ℃延伸15 s，40个循环。以泛素蛋白基因Ubiquitin(AK059011)为内参，每个样品3次技术重复，以2-ΔΔCt法分析qPCR的结果。

表1 qPCR实验中所用的引物Table 1 Primers used in qPCR

1.4 水稻LEA_2家族成员不同逆境处理下的表达模式分析

粳稻品种日本晴营养期干旱胁迫的转录组数据GSE65022从NCBI的GEO数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)下载。基于获得的干旱胁迫后的实验组和对照组的转录组数据，对status为“ok”且P<0.05的LEA_2基因的表达量进行比较分析。日本晴苗期的5种不同胁迫的基因表达芯片数据GSE7530从NCBI的GEO数据库下载。基于水稻在5种不同逆境处理下的芯片数据，获得了23个水稻LEA_2基因(OsLEA2-4、OsLEA2-5、OsLEA2-8、OsLEA2-9、OsLEA2-10、OsLEA2-11、OsLEA2-14、OsLEA2-18、OsLEA2-19、OsLEA2-20、OsLEA2-21、OsLEA2-23、OsLEA2-24、OsLEA2-26、OsLEA2-34、OsLEA2-35、OsLEA2-37、OsLEA2-45、OsLEA2-51、OsLEA2-52、OsLEA2-54、OsLEA2-59、OsLEA2-60)在不同逆境处理下lgFC值(FC表示fold change，是实验组与对照组表达量的比值)，并将lgFC还原为FC即相对表达量后作图。

2 结果与分析

2.1 水稻LEA_2家族成员的搜索和鉴定

通过“HMM search”获得72条水稻LEA_2家族成员的候选蛋白序列，同时利用拟南芥[16]和小麦LEA_2家族成员的蛋白序列[17]查找同源序列，分别获得7条和89条水稻LEA_2家族成员的候选蛋白序列。不同来源的序列汇总并去除重复后，一共得到了67条可能编码LEA_2蛋白的候选序列。将这些蛋白序列在Pfam数据库中进行结构域搜索确认，发现其中3条序列不含LEA_2结构域，最终得出64条水稻LEA_2蛋白序列，它们由60个LEA_2基因编码。选择每个基因的第一条转录本为该基因的代表序列，根据其在基因组上的位置依次将60个LEA_2基因分别命名为OsLEA2-1～OsLEA2-60(表2)。

表2 水稻 LEA_2家族成员理化性质Table 2 Physicochemical properties of rice LEA_2 family members

续表2 Continued Table 2

2.2 水稻LEA_2基因的染色体定位

60个水稻LEA_2基因在水稻的12条染色体上均有分布(图1)。其中，1号染色体最多，有13个基因；10号染色体最少，只有1个；5号染色体有7个，7号染色体有6个，2号、3号、4号和12号染色体均为5个，8号和11号染色体各有4个，6号染色体上有3个，9号染色体上有2个(图1)。

图1 水稻LEA_2基因的染色体位置Fig.1 Chromosome positions of rice LEA_2 genes

2.3 水稻LEA_2家族蛋白的理化性质

水稻LEA_2家族蛋白的平均长度为243 aa，有52个LEA_2蛋白长度在150 ～ 300 aa，最长的蛋白(OsLEA2-13)含有455个氨基酸，最短的蛋白(OsLEA2-2和OsLEA2-34)含有151个氨基酸。水稻LEA_2家族蛋白分子质量都偏小，最小的只有16.24 ku(OsLEA2-2)，最大的也只有49.14 ku(OsLEA2-13)。水稻LEA_2家族蛋白的等电点分布较广，在4.70 (OsLEA2-7)到11.70 (OsLEA2-32)；其亲水值在-0.647 (OsLEA2-12)到0.597 (OsLEA2-43)，其中只有18个蛋白质GRAVY值<0，倾向于亲水；其他42个蛋白质的GRAVY值均>0，倾向于疏水(表2)。

2.4 水稻LEA_2家族的系统进化、保守基序及基因结构分析

系统进化分析表明，60个水稻LEA_2家族成员可分为5个组(I ～ V)，分别包含17、11、15、6与11个水稻LEA_2基因(图2A)。分析水稻LEA_2家族成员的保守基序情况，共发现10种保守基序(Motif 1 ～ 10)，聚类到同一个组的LEA_2家族成员包含的保守基序类型基本相同，不同组成员间存在一定的差异(图2B)。另外，95%的LEA_2基因有3 ～ 6个基序，主要是Motif 1、Motif 2和Motif 8，其中96.7%成员含有Motif 1，86.7%的成员含有Motif 2，66.7%的成员含有Motif 8。

基因结构分析表明，水稻LEA_2家族成员的基因结构相对简单，不含或者很少含有内含子，所有基因的外显子均不超过3个，其中，83.3%的基因只有1个外显子区，11.7%的基因有2个外显子区，5%的基因有3个外显子区(图2C)。另外，进化关系较近的基因具有相似数量的外显子和内含子。这表明水稻LEA_2基因家族在进化上比较保守，这种基因结构的进化保守性可能与LEA蛋白参与许多重要的生物学过程密切相关。

A：水稻LEA_2家族成员的系统进化树； B：水稻LEA_2家族成员的保守基序分布； C：水稻LEA_2基因的基因结构。A：The phylogenetic relationship of rice LEA_2 family members; B：Distribution of conservative motifs of rice LEA_2 family members; C：Gene structures of rice LEA_2 genes.图2 水稻LEA_2家族成员的系统进化、保守基序及基因结构Fig.2 Phylogenetic relationship,conserved motifs and gene structures of rice LEA_2 family members

2.5 水稻LEA_2家族基因启动子区的顺式作用元件

对60个LEA_2基因起始密码子上游2 kb区域内的启动子序列进行在线分析，发现60个基因的启动子区域共包括1 712个顺式作用元件。其中与生长发育相关的元件有678个光响应调控元件、49个分生组织调控元件、8个种子特异性调控元件等；与激素信号传导途径相关的元件包括308个茉莉酸甲酯响应元件、212个脱落酸响应元件、44个生长素响应元件等；与非生物逆境胁迫有关的元件包括38个低温胁迫响应元件、52个干旱胁迫响应元件、99个厌氧诱导响应元件等(图3)。在水稻LEA_2基因家族，有83.3%的成员含有ABA的响应元件ABRE，有58.3%的成员含有干旱响应元件MBS，有48.3%的成员含有低温的响应元件LTR。这些结果说明LEA_2基因家族成员可能在干旱、低温等逆境胁迫中受到激发从而发挥其保护植物的作用。

图3 水稻LEA_2启动子区的顺式元件比较分析Fig.3 Comparison analysis of cis-elements in rice LEA_2 promoter regions

2.6 水稻LEA_2家族基因的组织表达谱

从CREP数据库搜索籼稻品种明恢63全生育期表达谱数据，获得51个OsLEA2基因在24个不同发育时期的表达情况，并进行分层聚类 (图4)。结果发现，水稻LEA_2基因的全生育期的表达模式总体可分为4类：第1类包含12个基因，其中除了OsLEA2-2、OsLEA2-3、OsLEA2-10、OsLEA2-16、OsLEA2-42等5个基因在受精不同时间的胚乳(M22、M23、M24)或发芽72 h后的种子(M1)中表达量较高外，其他成员在大多数时期都处于较低水平；第2类包含11个基因，其中OsLEA2-8、OsLEA2-41、OsLEA2-46在雄蕊(M18)或颖壳(M20)这类花器官中表达量最高，OsLEA2-18、OsLEA2-44在营养器官茎(M18)中表达量最高，该类基因在其他时期的表达量都处于中等偏低水平；第3类包含14个基因，该类基因在所有的幼穗组织(M12 ～ M16)中表达量偏低，在其他大部分时期中的表达量偏高；第4类包含14个基因，与第1类的12个基因相反，在大多数时期的表达量都比较高。总体上，在整个水稻LEA_2家族基因间共表达现象明显，4类基因大致表现出4种表达模式，即每一类里的基因表达模式都比较相似，暗示LEA_2家族内可能存在功能冗余现象。

从第2类和第4类基因中各挑选2个基因，采用qPCR的方法分析它们在粳稻品种日本晴抽穗期的根、茎和穗中的表达水平，结果与籼稻品种的表达谱芯片一致：属于第2类的OsLEA2-18和OsLEA2-44整体的表达水平偏低，根和穗中的表达水平相近，茎中的表达量相对高出约1倍；属于第4类的OsLEA2-24和OsLEA2-60在抽穗期的根中表达量低，穗中的表达量是根中的5倍以上，茎中的表达量又是穗中的2倍左右；此外，每一类中的2个基因的表达模式均高度相似(图5)。

2.7 水稻LEA_2家族基因在不同逆境处理下的表达谱

基于日本晴营养期植株干旱胁迫后的转录组数据，筛选得到了18个基因的可靠数据，其中13个基因在胁迫组中的表达量比对照组高，说明它们被干旱胁迫诱导上调表达，另外5个基因在胁迫组中的表达量比对照组低，说明干旱胁迫使它们下调表达(图6)。干旱诱导上调表达的基因中，有12个上调显著(2倍以上)，其中OsLEA2-26上调倍数最高达到99.37倍，OsLEA2-2上调60.10倍，OsLEA2-11和OsLEA2-27均上调约30倍，OsLEA2-3和OsLEA2-8均上调约10倍(图6A)；干旱诱导下调表达的5个基因，OsLEA2-5、OsLEA2-14、OsLEA2-24、OsLEA2-37和OsLEA2-60分别下调77%、81%、81%、91%和73%(图6B)。

基于日本晴幼苗在不同逆境处理前后的基因表达芯片数据，获得了23个OsLEA2基因在不同逆境处理下的表达情况。结果发现，只有OsLEA2-24和OsLEA2-60检测到了2倍以上的表达量差异；OsLEA2-24在10 ℃冷处理24 h后表达量较处理前上调7.29倍，处理48 h后表达量迅速下降到处理前的84%，处理72 h后表达量又上升到处理前的1.51倍；OsLEA2-60在淹水处理24 h后表达量上调3.72倍，随着处理时间的延长，OsLEA2-60表达量上调依次减小至2.55倍(处理48 h)、1.84倍(处理72 h)，OsLEA2-60基因在干旱处理24 h后表达量上调3.79倍(图7)。

绿色表示低表达；红色表示高表达；M1：发芽72 h后的种子；M2：萌发后的胚芽和胚根；M3：三叶期的幼苗；M4：2分蘖期的茎；M5：2分蘖期的根；M6：二次枝梗分化期的叶鞘；M7：减数分裂期的叶鞘；M8：二次枝梗分化期的叶；M9：减数分裂期的叶；M10：抽穗前5 d的剑叶；M11：抽穗14 d后的剑叶；M12：二次枝梗分化期的幼穗；M13：雌雄蕊分化期的幼穗；M14：花粉母细胞形成期的幼穗；M15：减数分裂期的幼穗；M16：抽穗期的幼穗；M17：抽穗前5 d的茎；M18：开花1 d前的雄蕊；M19：抽穗期的茎；M20：开花1 d前的颖壳；M21：开花3 d后的小穗；M22：受精7 d后的胚乳；M23：受精14 d后的胚乳；M24：受精21 d后的胚乳。Green denotes low expression; Red denotes high expression; M1:Seed,72 h after imbibition; M2:Embryo and radicle after germination; M3:Leaf and root at three-leaf stage; M4:Shoot,seedling with 2 tillers; M5:Root,seedling with 2 tillers; M6:Sheath,young panicle at stage 3; M7:Sheath,4-5 cm young panicle; M8:Leaf,young panicle at stage 3; M9:Leaf,4-5cm young panicle; M10:Flag leaf,5 days before heading; M11:Flag leaf,14 days after heading; M12:Young panicle at stage 3; M13:Young panicle at stage 4; M14:Young panicle at stage 5; M15:Panicle,4-5cm young panicle; M16:Panicle,heading stage; M17:Stem,5 days before heading; M18:Stamen,one day before flowering; M19:Stem,heading stage; M20:Hull,1 day before flowering; M21:Spikelet,3 days after pollination; M22:Endosperm,7 days after pollination; M23:Endosperm,14 days after pollination; M24:Endosperm,21 days after pollination.图4 不同组织中OsLEA2基因的表达谱分层聚类Fig.4 Hierarchical clustering of OsLEA2 genes in different tissues

根中的表达量定为1，标准差来自于3次技术重复。The expression levels in root are arbitrarily set as 1,and the SD are based on three technical replicates.图5 OsLEA2基因在抽穗期不同组织中的表达水平Fig.5 Expression level of OsLEA2 genes in different tissues at heading stages

A：上调；B:下调。A:Up regulated; B:Down regulated.图6 OsLEA2基因干旱胁迫后的表达模式Fig.6 Expression patterns of 18 OsLEA2 genes after drought stress

A：OsLEA2-24冷胁迫 OsLEA2-24 cold stress; B:OsLEA2-60淹水胁迫 OsLEA2-60 flooding stress; C:OsLEA2-60干旱胁迫 OsLEA2-60 drought stress.图7 OsLEA2基因在不同逆境处理下的表达水平Fig.7 Expression level of OsLEA2 genes under different stress conditions

3 讨 论

Battaglia等[14]将LEA蛋白分为7个组，其中第5组是非典型的疏水性蛋白，根据序列相似性分为5A、5B和5C三个亚组，5C亚组即LEA_2家族。Wang等[13]2007年从水稻基因组鉴定的LEA_2基因OsLEA5、OsLEA6、OsLEA7和OsLEA8，在本研究中分别命名为OsLEA2-2、OsLEA2-6、OsLEA2-23和OsLEA2-34。目前，仅有关于OsLEA2-34(OsLEA5c)基因功能的研究报道[2,18]。

本研究通过籼稻明恢63全生育期的基因表达芯片对51个OsLEA2基因的表达情况进行分层聚类，发现它们的表达模式大致可分为4类，4类基因间共表达现象明显。在粳稻品种日本晴抽穗期的根、茎、穗中，用qPCR的方法分别检测第2类基因OsLEA2-18和OsLEA2-44及第4类基因OsLEA2-24和OsLEA2-60的表达情况，结果发现属于同类的2个基因的表达模式高度相似(图5)，验证了表达谱分层聚类的结果。另外，LEA基因在高等植物的种子中大量表达[5]，籼稻的芯片数据显示只有第1类的OsLEA2-2和OsLEA2-16仅在受精后的胚乳中表达较高，以及第4类的OsLEA2-19、OsLEA2-20、OsLEA2-23、OsLEA2-27、OsLEA2-34、OsLEA2-54和OsLEA2-55等7个基因几乎在全部24个组织中都有较高的表达量，有25个基因(包括第1类中除OsLEA2-2、OsLEA2-3、OsLEA2-16、OsLEA2-42之外的8个基因，第2类全部11个基因，第3类的OsLEA2-21、OsLEA2-33、OsLEA2-37、OsLEA2-59等4个基因，第4类的OsLEA2-17 和OsLEA2-60 等2个基因)不同于先前发现的LEA基因，在受精后的胚乳中表达量持续较低(图4)。此外，这25个基因中，OsLEA2-10仅在发芽72 h的种子中表达量稍高，OsLEA2-46仅在开花前1 d的雄蕊中表达量稍高，OsLEA2-41仅在幼穗和雄蕊中表达量高，OsLEA2-18和OsLEA2-44仅在抽穗期的茎中表达量稍高，暗示这5个基因可能分别只在种子萌发、幼穗或雄蕊发育等过程中发挥功能。

前人的研究发现植物在遭受干旱、低温、ABA处理、盐处理等逆境胁迫后，LEA蛋白在植物不同的组织部位都可能大量表达[6]。通过分析水稻LEA_2家族基因启动子区的顺式作用元件发现，有83.3%的基因含有ABA的响应元件，58.3%的基因含有干旱响应元件，48.3%的基因含有低温响应元件。基于日本晴营养期植株干旱胁迫后的转录组发现，干旱胁迫诱导12个基因显著上调表达和5个基因显著下调表达(图6)；其中，OsLEA2-2和OsLEA2-26在干旱胁迫组中的表达量分别是对照组的60.10倍和99.37倍，OsLEA2-2启动子包含低温响应元件(LTR)1个、干旱响应元件(MBS)2个、ABA响应元件(ABRE)14个，OsLEA2-26启动子包含ABRE 5个，可以将这2个基因作为培育抗旱水稻品种的候选基因开展更深入的研究。

本研究基于冷胁迫、聚乙二醇(PEG)模拟的干旱胁迫、淹水胁迫、甘露醇引起的渗透胁迫和盐胁迫共5种处理前后的日本晴幼苗的芯片数据，研究了23个OsLEA2基因处理前后幼苗表达量的变化，发现只有OsLEA2-24在冷处理后表达上调超7倍，OsLEA2-60在淹水和干旱处理24 h后表达量均上调近4倍(图7)。Huang等[2]报道OsLEA2-34在PEG模拟的干旱处理1 h后，表达量迅速上调超6倍，6 h后表达量下降至不到2倍；盐胁迫1 h后，OsLEA2-34基因上调表达超过3倍，6 h后表达量几乎回复到处理前的水平。本研究中，OsLEA2-34基因在任何处理的任何时间点均未发现其表达量的明显变化(数据未展示)。基因的内含子多会延迟调控反应，表达水平在应激反应中迅速变化的基因含有明显较低的内含子密度[19]。水稻LEA_2家族的基因不含或者很少含有内含子，其表达水平在应激反应中的变化应该比较迅速，但本研究中，5种逆境处理前后的水稻幼苗的表达水平变化差异较小。综合上述结果推测，水稻LEA_2家族基因启动子上存在大量ABA及非生物逆境胁迫响应元件，可能赋予它们在数小时之内迅速响应干旱或冷胁迫等环境的能力，而10日龄日本晴幼苗芯片数据中的样品大部分在处理24 h后采集，这可能是绝大部分基因未检测到表达量显著变化的原因。