致病性大肠杆菌诱导的小鼠子宫内膜炎模型建立

2021-04-21孙凯鑫王友元石丽颖李前庆刘红羽吕文发

中国畜牧杂志 2021年4期

孙凯鑫，王友元，石丽颖，李前庆，刘红羽，赵静，王军*，吕文发*

（1.现代农业技术教育部国际合作联合实验室，吉林长春 130118；2.动物生产及产品质量安全教育部重点实验室，吉林长春 130118）

子宫内膜炎是因子宫内膜感染而引起的炎症，会延迟繁殖周期并降低动物的生产能力，对养殖业造成巨大的经济损失[1-2]。产后生殖道扩张，细菌等病原微生物感染均可导致子宫内膜炎发生，其中细菌感染是子宫内膜炎发生的主要诱因[3-4]。大肠杆菌是引起子宫内膜炎的常见致病菌，其作为革兰氏阴性菌，外壁层包含着大量脂多糖，而脂多糖是炎性细胞的主要激活物，可诱导中性粒细胞激活，导致炎性细胞因子的产生与释放[5]。炎症反应的特征主要包括炎性介质和细胞因子的大量产生，而细胞因子中促炎和抗炎的稳态失衡，导致炎症持续性产生并使组织破坏引起疾病[6]。研究表明，炎症介质的产生受核因子κB（NF-κB）的影响[7]。NF-κB信号通路激活可通过上调促炎细胞因子白细胞介素-1β（IL-1β）、白细胞介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的表达来调节炎症反应[8-9]。为进一步探究大肠杆菌诱导小鼠子宫内膜炎症的发生，本研究向小鼠子宫内灌注致病性大肠杆菌（EPEC）建立小鼠子宫内膜炎模型，并通过检测组织病理学变化、炎性因子IL-6、IL-1β和TNF-α及NF-κB 蛋白表达以验证模型是否建立成功，进一步探究大肠杆菌诱导的子宫内膜炎的损伤机制，为子宫内膜炎的治疗提供一定研究基础。

1 材料与方法

1.1 试验动物本试验选择8～10 周龄、体重30～35 g的SPF 级健康ICR 雌性小鼠24 只，购自辽宁长生生物技术股份有限公司，动物生产许可证号：SCXK（辽）2020-0001。

1.2 试验仪器微量移液器（10～100 μL，德国 Eppendorf）、石蜡切片机、分析天平（ME104E，梅特勒）、恒温恒湿箱（HPX-160BSH-III，上海新苗医疗器械制造有限公司）、光学显微镜（BA410E，Motic Europe）、超净工作台（HS-840u，苏州净化设备有限公司）、实时荧光定量PCR 仪（Mx3000P，上海吉泰生物科技有限公司）、梯度PCR 仪（Veriti，Thermo Fisher Scientific）。

1.3 细菌培养致病性大肠杆菌（EPEC）由本实验室提供。将冻存的大肠杆菌放至室温，用接种环蘸取菌液在LB 固体培养基上连续划线，恒温箱37℃培养24 h后用接种环挑取单菌落于LB 液体培养基中培养8 h，纯化3 次后予以备用。

1.4 子宫内膜炎模型的建立将24 只小鼠经过适应性喂养7 d 后，随机分为4 组，每组6 只，3 个炎症模型组分别使用留置针向小鼠子宫内灌注1×106、1×108、1×1010CFU/mL 的大肠杆菌25 μL，对照组向小鼠子宫内灌注等体积的生理盐水，灌注24 h 后将所有小鼠剖检并进行采样。

1.5 病理组织切片染色剖检小鼠，取小鼠子宫角中段使用4%多聚甲醛固定1 周，埋在石蜡中制作石蜡切片，进行切片、脱蜡、水化和染色等过程制作HE 染色切片，光学显微镜下观察各组小鼠子宫组织的病理变化。

1.6 荧光定量PCR 根据NCBI 查找并设计小鼠的IL-6、IL-1β和TNF-α序列引物，均由生工生物工程（上海）有限公司合成，引物信息见表1。Trizol 法提取小鼠子宫组织的RNA，按照TaKaRa 试剂盒将提取的RNA 反转录为cDNA，荧光定量PCR 检测IL-6、IL-1β和TNF-α的mRNA 表达。荧光定量PCR 反应体系：10 μL SYBR Premix Ex Taq II、6 μL ddH2O、上下游引物（10 μmol/L）各0.8 μL，0.4 μL ROX reference Dye II，2 μL cDNA 模板。反应条件：95℃预变性30 s，95℃变性5 s，60℃退火34 s，95℃复性15 s，扩增40个循环。

表1 引物信息

1.7 酶联免疫吸附实验小鼠子宫内膜炎炎症模型建立完成后，收集小鼠子宫，进行组织研磨。取1 g 组织，加入9 mL 的pH 为 7.2～7.4 的PBS，用手工或者匀浆器将标本匀浆充分。离心20 min（2 000～3 000 r/min），仔细收集上清。按照ELISA 说明书进行操作，检测细胞因子IL-6、IL-1β和TNF-α的变化，试剂盒为江苏酶免实业有限公司提供。

1.8 Western Blot 测定NF-κB 蛋白表达取小鼠子宫组织称重0.1 g 研磨，BCA 法测定各组样品蛋白浓度。使用SDS-PAGE电泳缓冲液将蛋白条带跑开以获得目的蛋白，使用转膜液将蛋白转移到PVDF 膜上（250 V、0.12 A、28 min）。将膜与封闭缓冲液37℃封闭2 h，加入一抗p65（1:1 000；Invitrogen）、p-p65（1:1 000；Invitrogen）、IκBα（1:1 000；Invitrogen）、p-IκBα（1:1 000；Invitrogen）、β-actin（1:10 000；Invitrogen）37℃ 孵育1.5 h。TBST缓冲液洗涤3 次后再加入二抗37℃孵育1 h，TBST 缓冲液洗涤3 次。最后使用Tanon Gis 软件进行蛋白条带的灰度值分析。

1.9 统计与分析利用GraphPad Prism 5.0 软件对试验所得数据进行单因素方差分析，结果均表示为平均值±标准误，P＞0.05 表示无统计学差异，P＜0.05 为差异显著，P＜0.01 和P＜0.001 为差异极显著。

2 结果与分析

2.1 炎症模型小鼠子宫组织HE 染色小鼠子宫组织HE 染色结果显示（图1），对照组小鼠的子宫组织结构正常，子宫内膜层与肌层界限分明，内膜间质细胞排列整齐，腺体大小均一，分布均匀，腺上皮及宫腔上皮完整。在1×106、1×108CFU/mL 大肠杆菌感染组中发现，子宫内膜层与肌层界限不清，腺体、宫腔上皮缺失，宫腔残余面积狭小。而在1×1010CFU/mL 大肠杆菌感染组中，小鼠子宫内膜层与肌层无明显界限，子宫内膜浅层上皮、腺腔和宫腔内形成微脓肿和中性粒细胞浸润。

图1 不同浓度的大肠杆菌对小鼠子宫组织HE 染色比较（×100）

2.2 荧光定量PCR 检测模型小鼠炎性因子的mRNA 表达如图2 所示，使用1×106CFU/mL 大肠杆菌灌注小鼠子宫24 h 后，与对照组相比，1×106CFU/mL 组炎性因子IL-6 和TNF-α的基因水平显著上升，1×108CFU/mL 组IL-6 和TNF-α的基因水平极显著上升，1×1010CFU/mL组IL-6、IL-1β、TNF-α基因水平极显著上升。

图2 炎症模型中炎性因子的基因表达水平

2.3 ELISA 检测模型小鼠炎性因子的分泌如图3 所示，与对照组相比，向子宫内灌注1×106CFU/mL 的大肠杆菌模型中IL-1β的分泌水平上升（P＜0.001），IL-6 和TNF-α分泌水平无变化。向子宫内灌注1×108CFU/mL的大肠杆菌后，IL-1β和TNF-α分泌水平上升（P＜0.01），IL-6 的分泌水平无显著变化。使用1×1010CFU/mL 的大肠杆菌24 h 后，IL-6（P＜0.01）、IL-1β（P＜0.001）和TNF-α（P＜0.01）3 种炎性因子的分泌水平均上升。

2.4 小鼠子宫组织中NF-κB 炎症通路相关蛋白的表达通过蛋白质免疫印迹实验检测小鼠子宫组织内的蛋白变化发现，大肠杆菌处理激活了NF-κB 通路，IκB-α与p65 的磷酸化水平上升（P＜0.05），NF-κB 的活性被显著激活，p-p65/p65（P＜0.01）和p-IκB-α/IκB-α（P＜0.05）表达量与对照组相比均上升（图4）。

图3 炎症模型中炎性因子的蛋白分泌水平的变化

图4 炎症模型小鼠对NF-κB 信号通路表达的影响

3 讨论

子宫内膜是分娩后抵御生殖道感染的第一道防线，主要发挥屏障作用[10-12]。细菌感染通常会促进免疫细胞的聚集并导致子宫的急性炎症[13]。大肠杆菌诱发的子宫损伤呈典型的炎症反应，子宫组织有严重的炎性反应，其特征是有脓肿形成和出现大量的白细胞浸润[14]。本研究参考以往动物子宫内膜炎模型的建立方法[15-16]，向小鼠子宫内灌注1×1010CFU/mL 致病性大肠杆菌24 h后，通过检测组织切片、炎性因子和炎症通路的变化来确定炎症发生，成功建立了小鼠子宫内膜炎的病理模型。

炎症是对病原体或内源性信号分子释放的先天免疫应答的重要组成部分[17]。许多促炎细胞因子、趋化因子和黏附因子的产生被认为与疾病过程中的炎症有关[18-19]。IL-6、IL-1β和TNF-α等促炎细胞因子在产后早期子宫内膜炎的发生中发挥重要作用[20]。IL-6 是感染和组织损伤后迅速产生的，它通过刺激急性期反应，造血作用和免疫反应来促进宿主防御[21]。白介素-1（IL-1）家族由几种促炎或抗炎蛋白组成，其中最主要的炎症介质是IL-1β，可通过与IL-1 的受体1 结合而导致发烧和免疫活化[22]。TNF-α是与TNF 受体1（TNFR1）结合时的关键促炎性细胞因子[23]。本试验中，利用1×1010CFU/mL的大肠杆菌灌注小鼠子宫24 h 后IL-6、IL-1β和TNF-α表达水平显著性上升，说明大肠杆菌能够引起炎症相关细胞因子的合成释放，从而导致子宫炎症的发生。

NF-κB 转录因子家族被认为是炎症过程的主要介质，是先天性和适应性免疫反应的关键参与者。在众多转录因子中，NF-κB 是调节促炎性产生的最重要因子[24]。NF-κB 在炎症反应过程中对促炎介质的调节中起关键作用，包括TNF-α、IL-1β、IL-6、iNOS 和COX-2[25-26]。据报道，NF-κB 是调节涉及免疫和急性期炎症反应的各种因子表达的关键转录因子[27]。本研究中，大肠杆菌增加了p-p65/p65 的蛋白水平，这表明大肠杆菌加强了NF-κB 的核转运；大肠杆菌感染后子宫组织中p-IκB-α蛋白水平升高，p-IκB-α/IκB-α显著高于对照组，这表明大肠杆菌激活了IκB-α向p-IκB-α发生转变。本研究结果显示，在小鼠子宫内膜炎模型中，与对照组相比，大肠杆菌能够通过引起细胞中的NF-κB 活化来增加促炎性介质产生，与相关研究报道一致[28-29]。以上研究表明大肠杆菌能够激活细胞中的NF-κB 来引起炎症反应。