鸡KRT14 基因编码区SNPs 及其与蛋壳品质性状的相关分析

沈涛涛 ，张佳兰，吴 艳，程诗彬，皮劲松，黄竹林，王孝忠

（1.长江大学动物科学学院，湖北荆州 434025；2.湖北省农业科学院畜牧兽医研究所，动物胚胎工程与分子育种湖北省重点实验室，湖北武汉 430064；3.武汉民族科技饲料有限公司，湖北武汉 430223；4.湖北省宜昌市动物疫病预防控制中心，湖北宜昌 443005）

蛋壳品质是蛋鸡生产性状的重要组成部分。已有研究表明，在日常消费中，人们对鸡蛋及其相关产品都具有极高的消费欲望[1]。蛋壳质量是鸡蛋品质的重要评价指标之一，对蛋鸡产业的经济效益有直接影响[2]。角蛋白14 属于富含半胱氨基酸残基的I 型（酸性）角蛋白，参与构成上皮细胞的骨架，且KRT14基因有参与细胞生长，促进细胞分化的功能。Petek 等[3]、Confalonieri等[4]研究表明，KRT14与中间丝纤维蛋白有亲缘关系，是人类癌症发生、发展的上皮性标记物；Jankowski 等[5]研究发现，KRT14表达量与人的单纯型大疱性表皮松解症、肺损伤等病状密切相关。然而，关于KRT14基因在蛋鸡上的研究未见报道。团队前期研究发现KRT14基因在蛋壳强度和蛋壳厚度表现极端的2 个群体中表达存在显著差异。另外，江汉鸡是湖北省分布最广蛋肉兼用型地方鸡品种，体型较小，采食少，生长速度慢，具有适应能力强、耐粗饲、产蛋较多、肉质细嫩、味美等特点[6]。因此，本实验以江汉鸡为研究对象，分析KRT14基因的SNP 标记及其单倍型组合与蛋鸡蛋壳品质性状的相关性，以期找到与鸡蛋蛋壳品质性状相关的分子标记，为培育具有优良蛋壳品质性状的蛋鸡品种提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 样品采集 汉江鸡样本来源于湖北省农业科学院畜牧兽医研究所家禽试验场。选取相同管理环境、健康的43 周龄的产蛋江汉母鸡414 只，翅静脉采血，用ACD（酸性柠檬酸葡萄糖）抗凝剂抗凝后冷冻保存。采集每个个体连续3 d 所产的蛋，测定每个蛋的蛋重、蛋壳强度、蛋壳厚度、蛋黄重等性状。

1.1.2 指标测定与方法 利用电子天平对蛋重进行测定蛋重。利用游标卡尺分别测定蛋壳钝端、中间和锐端部位3 个点的蛋壳厚度（剥离蛋壳膜后），计算平均值为蛋壳厚度。采用蛋壳强度分析仪（NFN388，日本FHK公司）进行测定蛋壳强度。

1.2 DNA 提取 鸡基因组DNA 利用北京百泰克生物技术有限公司生产的基因组DNA 试剂盒（按试剂盒说明书操作）提取，经琼脂糖凝胶电泳检测后用微量紫外分光光度计测定浓度，用超纯水稀释所有样品终浓度为100 ng/μL。

1.3 引物设计与PCR 扩增 根据NCBI 数据库公布的鸡KRT14基因cDNA 序列（登录号Gene ID：NM_00100 1311.2），利用Primer 5.0 设计3 对引物扩增KRT14基因编码区。引物序列见表1。引物由北京奥科生物技术有限公司合成。

以提取的鸡基因组DNA 为模板进行PCR 扩增。20 μL 扩增体系：2×Taq PCR mix 10 μL，上、下游引物 各0.5 μL（10 μmol/L），DNA 模 板1 μL，加超纯水补足至20 μL。反应条件：94℃ 2 min；94℃ 15 s、55℃ 30s、68℃ 90s，共35 个循环，68℃ 10 min。

1.4 测序 利用设计KRT14基因的3 对引物在江汉鸡群体中进行SNPs 突变位点筛选，将扩增获得的PCR产物利用浓度为1.0%琼脂糖凝胶电泳检测合格后，由北京奥科生物技术有限公司进行测序。

1.5 序列分析 利用DNA Star 软件进行测序结果的比对分析；利用Haploview 软件分析不同多态性位点的单倍型，利用PHASE 软件分析不同位点间的连锁不平衡。

1.6 统计分析 利用Excel 软件计算各突变位点的基因型频率、等位基因频率及哈代-温伯格平衡检验。采用SPSS 18.0 软件一般线性模型中的One-Way ANOVA 进行不同位点基因型与表型之间的关联分析，结果以平均值± 标准差表示。模型：Yij=u+Pj+Gi+eij，其中Yij为性状观察值，u 为性状总平均值，Pj为固定效应，Gi为基因型效应，eij为随机误差。

表1 PCR 扩增引物序列

2 结果与分析

2.1KRT14基因编码区SNPs 检测及基因型频率分析 3个引物经过扩增、纯化、送测后的测序结果与KRT14基因经过序列比对后发现，仅在KRT14-2 片段获得4 个SNPs，分别为位于第184、215、275、277 bp 处的T/C、T/C、A/C 和A/G 4 个突变位点，命名为g.184 bp C＞T、g.215 bp C＞T、g.275 bp C＞A 和g.285 bp G＞A，均为同义突变。4 个SNPs 位点在江汉鸡群体中的基因型频率、等位基因频率结果见表2，4 个SNPs 位点均存在3 种基因型，g.184 bp C＞T、g.215 bp C＞T、g.275 bp C＞A和g.285 bp G＞A 这4 个位点的优势等位基因分别为C、C、A 和G，优势等位基因型分别为CT、CC、AA 和GG。

表2 蛋鸡KRT14 基因基因型频率和等位基因频率

2.2KRT14基因SNPs 与鸡蛋蛋品质性状的相关性分析 将检测到的4 个突变位点不同基因型与鸡蛋品质性状进行关联分析，结果如表3 所示，KRT14基因突变位点g.184 bp C＞T、g.215 bp C＞T、g.275 bp C＞A、g.285 bp G＞A，不同基因型与蛋重、蛋壳厚度、蛋壳强度等具有相关性（P＜0.05）。其 中g.184 bp C＞T 位点的CT 基因型、g.215 bp C＞T位点的CT 基因型、g.275 bp C＞A 位点的CC 基因型及g.285 bp G＞A 位点的GG 基因型具有更高的蛋壳强度和蛋壳厚度。

表3 蛋鸡KRT14 基因4 个突变位点的多态性与鸡蛋品质性状的关联分析（平均值±标准差）

2.3 不同突变位点的单倍型组合鉴定

2.3.1 单倍型与单倍型组合的构建KRT14-2区域的4 个SNPs 突变位点，共形成了9 种单倍型，分别为CCAG、CCCG、CTAA、TCAG、TCAA、TCCG、TTAG、TTAA 和TTCG。利用PHASE 程序分析每个个体不同位点间的成对连锁不平衡程度及单倍型block，结果如图1 所示，根据4 个突变位点的连锁不平衡分析，共找到1 个单倍型block，对该单倍型block 进行单倍型分析，在本实验的江汉鸡群体中发现9 种单倍型，分别命名为H1～H9。对H1～H9 组成的每个个体的单倍型组合进行分析，共发现23 种单倍型组合，见表4。

图1 KRT14 基因单倍型域结构图

表4 KRT14 基因单倍型组合

2.3.2 单倍型组合与蛋壳品质性状的关联分析 在形成的23 种单倍型组合中，选择数量最多的6 种优势单倍型组合与鸡蛋蛋壳品质性状进行关联分析，结果见表5。H1H9（其序列为CCAG/TTCG）单倍型组合个体的蛋壳强度、蛋壳厚度均高于其他单倍型组合个体（P＜0.05）。因此，在本实验群体中H1H9（其序列为CCAG/TTCG）单倍型组合具有最佳的蛋壳品质性状。

表5 优势单倍型与蛋壳品质性状的关联分析结果

3 讨 论

鸡蛋蛋壳强度和蛋壳厚度是影响鸡蛋破损率和货架期的重要因素，直接影响蛋鸡养殖的经济效益。蛋壳质量是影响鸡蛋品质的重要因素，因此解析影响鸡蛋蛋壳品质的形成及其调控机制是提高鸡蛋蛋壳品质的有效手段之一。已有研究表明，角蛋白（Keratin，KRT）基因主要表达于上皮细胞，是上皮细胞中最丰度的结构蛋白，也是表皮、毛囊、毛发和指甲的重要组成结构，为网状结构，属于角质层的骨架蛋白[7-8]；其具有维持上皮细胞完整性、保护上皮细胞正常功能的运行[9]等作用，与细胞运动、增殖和细胞间的信息传递有关[10-11]。此外，研究发现KRT14基因在宫颈组织的上皮细胞中高度表达，使上皮细胞过度增殖[12-13]；可能通过与蛋白激酶4（RIPK 4）相互作用从而调节角质形成细胞分化所需的角蛋白转换[14]。KRT14和KRT5突变使异常角蛋白聚集于细胞核下及半桥粒，导致表皮基底细胞中间丝形成障碍，破坏了蛋白网络的完整性和半桥粒的稳定性，使角质形成细胞受到外力时容易破裂，皮肤脆性增加[15]。本研究也发现，KRT14基因上的4 个SNPs 突变与蛋壳厚度、蛋壳强度、蛋重、蛋黄重性状显著相关，且单倍型组合H1H9 个体的蛋壳强度、蛋壳厚度均显著高于其他单倍型组合个体。综上，推测KRT14基因可能与蛋壳强度和蛋壳厚度相关，KRT14基因可以作为影响鸡蛋蛋壳品质性状的候选基因，而本研究获得的4 个SNPs 突变位点可作为蛋壳品质性状分子标记辅助选择的候选标记。

4 结 论

本实验结果显示，在江汉鸡KRT14基因编码区内共发现g.184 bp C＞T、g.215 bp C＞T、g.275 bp C＞A 和g.285 bp G＞A 4 个SNPs，均为同义突变；其中g.184 bp C＞位点的CT 基因型、g.215 bp C＞T 位点的CT 基因型、g.275 bp C＞A 位点的CC 基因型及g.285 bp G＞A 位点的GG 基因型具有更高的蛋壳强度和蛋壳厚度；单倍型组合H1H9（其序列为CCAG/TTCG）具有最佳的蛋壳品质性状。因此，KRT14基因编码区的4 个SNPs 突变位点可作为蛋壳品质性状分子标记辅助选择的候选标记。