绵羊前体脂肪细胞分化过程中HOXC8 DNA甲基化的研究
2021-04-21赵弼时刘建华乔利英刘旭莹刘文忠
赵弼时,刘建华,乔利英,刘旭莹,王 凤,刘文忠
(山西农业大学动物科技学院,山西太谷 030801)
脂肪组织在能量代谢中具有重要作用[1]。绵羊作为世界上主要的肉类家畜资源之一,过多的白色脂肪堆积会影响其胴体品质[2]。同源框基因(Homeobox,HOX)家族编码一类重要的发育转录因子。绵羊HOX基因家族有39 个成员,分属于HOXA、HOXB、HOXC和HOXD4 个基因集群[3]。该家族的许多成员参与脂肪形成[4-5]。HOXC8作为HOX家族的一员,在调控细胞成肌[6]、成骨[7]以及成脂分化等生物过程中发挥重要作用。对成脂分化的研究表明,HOXC8抑制人脂肪源性干细胞(Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cells,ADSCs)的分化和脂质沉积[8],且在不同的脂肪组织中差异表达[9-10]。可见,HOXC8在脂质沉积中发挥着重要作用。
DNA 甲基化是一种主要的表观遗传修饰方式。在3T3-L1 脂肪细胞分化过程中过氧化物酶体增殖物激活受体γ(Peroxisome Proliferator-Activated Receptor Gamma,PPARγ)启动子区去甲基化,使其表达量升高,促进脂肪细胞分化[11]。人前体脂肪细胞中瘦素(Leptin,LEP)启动子区呈高甲基化状态时抑制其转录[12],利于脂肪细胞的分化和脂滴沉积[13]。以上研究表明,脂肪分化相关基因可通过DNA 甲基化修饰来调控脂质代谢。生物信息学预测发现HOXC8启动子区和第1 外显子区各存在1 个CpG 岛,为研究HOXC8的DNA 甲基化在绵羊脂质代谢中的作用提供了新的切入点。本研究旨在通过阐明绵羊前体脂肪细胞分化过程中HOXC8DNA甲基化程度及其转录的调节机制,为深入开展绵羊脂肪代谢机理的研究提供基础。
1 材料与方法
1.1 实验材料 将3 只15 日龄小尾寒羊屠宰后迅速去除皮毛,用无菌的剪刀、镊子剪下0.5 cm × 0.5 cm 的皮下脂肪组织块。用含有1%双抗(青霉素和链霉素)的无菌PBS 溶液冲洗2~3 遍后,将组织块浸泡于15 mL含有双抗的PBS 溶液的离心管中,冷藏保存带回实验室。
1.2 主要试剂 琼脂糖凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒购自Omega 公司;LB 固体培养基和液体培养基购自北京索莱宝公司;基因组DNA 提取试剂、pMDTM19-T 载体、Trizol 试剂、各种工具酶、反转录试剂盒、TaKaRa EpiTaqTMHS(for bisulfite-treated DNA)试剂盒和qPCR试剂盒购自TaKaRa 公司;EpiTect Fast DNA Bisulfite Kit 试剂盒购自凯杰生物技术有限公司;双抗、胎牛血清和高糖DMEM 培养液购自Biological Industries 公司。
1.3 实验方法
1.3.1 CpG 岛预测分析 根据NCBI GenBank 数据库上公布的绵羊HOXC8基因序列,利用MethPrimer 软件(http://www.uro-gene.org/cgi-bin/methprimer/methprimer.cgi)预测绵羊HOXC8基因序列(转录起始位点上游2 000 bp 和完整基因序列)的CpG 岛位置,参数设置为Observed/Expected radio>0.60,Percent C+Percent G>50.00,Length>200。
1.3.2 绵羊前体脂肪细胞的分离培养及诱导分化 按照参考文献[14-16]中的方法,在严格无菌的环境下,使用II 型胶原酶从绵羊背部皮下脂肪组织中分离得到前体脂肪细胞。在37℃、5% CO2的条件下,用含1%双抗和10%胎牛血清的高糖DMEM 培养液培养绵羊前体脂肪细胞,每2 天更换一次培养基。当绵羊前体脂肪细胞汇合度达到80%左右时,用诱导分化培养液(在上述培养液中添加1 μmol/L 地塞米松,1 mg/L 胰岛素,0.5 mmol/L IBMX)进行诱导分化,每2 天换一次液,分别在分化第0、2、4、6、8、10、12 天收集细胞用于HOXC8时序表达的检测和甲基化水平检测。
1.3.3 细胞总DNA 的提取 使用DNAiso Reagent 按照说明书分别提取分化第0 天和第2 天的绵羊前体脂肪细胞中的基因组DNA。
1.3.4 细胞总RNA 的提取 使用RNAiso Plus 按照说明书提取所收集细胞的总RNA,利用紫外分光光度计检测样品总RNA 浓度及OD260nm/OD280nm。
1.3.5 qPCR 根据NCBI 核酸数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)中公布的绵羊HOXC8基因的mRNA 序列,以β-Actin作为内参基因,设计qPCR 引物,引物序列见表1。根据反转录试剂盒Prime Script®RT reagent kit with gDNA Eraser 的说明书对所提取的RNA进行反转录获得cDNA。以cDNA 为模板,用SYBR®Premix Ex TaqTMII 试剂盒进行实时荧光定量PCR检测mRNA 的表达量。反应总体系为20 μL:TB Green Premix Ex Taq II(2×)10 μL,上、下游引物(10 μmol/L)各0.8 μL,cDNA 产物2 μL,ddH2O 6.4 μL。反应程序:95℃预变性30 s;PCR 反应阶段95℃ 15 s、60℃ 30 s,39 个循环;熔解曲线分析阶段95℃ 15 s,60℃ 1 min,95℃ 15 s。
表1 HOXC8 和β-Actin mRNA 的qPCR 引物
1.3.6HOXC8CpG 岛甲基化水平检测 利用在线程序NEBuilder(http://nebuilder.neb.com/)软件对HOXC8启动子区和第1 外显子区进行甲基化引物设计,引物序列见表2。先利用EpiTect Fast DNA Bisulfite Kit 试剂盒对基因组DNA 进行亚硫酸氢盐转化,然后利用TaKaRa EpiTaqTMHS (for bisulfite-treated DNA)试剂盒进行PCR 扩增,总体系为20 μL:TaKaRa EpiTaq HS 0.1 μL,EpiTaq PCR Buffer(10×)2 μL,25 mmol/LMgCl22.4 μL,dNTP Mixture 2.4 μL,DNA 模板2 μL,上、下游引物各2 μL,ddH2O 7.1 μL。反应程序:94℃预变性5 min;PCR 扩增94℃ 30 s、50℃ 30 s、72℃ 1 min,40 个循环;4℃保存。用2% 的琼脂糖凝胶鉴定PCR扩增产物,用胶回收纯化试剂盒回收目的片段并用紫外分光光度计检测其浓度,将浓度高的纯化产物与pMDTM19-T 载体连接,连接产物经感受态细胞DH5α转化后涂板,培养12 h 后挑选阳性克隆,随机挑取20个阳性克隆送华大基因测序。将甲基化引物扩增的序列和原始DNA 序列以及转化序列比对,统计发生甲基化的CpG 岛。
表2 HOXC8 甲基化水平检测引物
1.3.7 数据分析 甲基化水平差异的显著性检验通过SPSS 统计分析软件(Version 21.0,美国)分析,结果以平均值± 标准误表示。使用MSR(http://www.msrcall.com/MSRcalcalate.aspx)软件分析BSP 测序结果,并用于甲基化图谱的绘制和分析。荧光定量数据采用2-ΔΔCT法计算基 因mRNA 相对表达量。使用GraphPad Prism7(GraphPad Software,美国)软件中的一般线性模型对数据进行方差分析。
2 结果与分析
2.1 绵羊HOXC8基因CpG 岛预测 生物信息学预测发现HOXC8基因启动子区存在1 个CpG 岛,位于HOXC8基因g.-397~-105 区域(图1A),HOXC8完整基因序列中存在1 个CpG 岛,位于HOXC8基因g.+98~+518 区域(图1B),覆盖其第1 外显子区。
2.2 绵羊前体脂肪细胞的培养效果与成脂能力 从绵羊皮下脂肪组织中分离出的前体脂肪细胞呈梭形,且细胞状态良好(图2A)。待绵羊前体脂肪细胞密度达到90% 左右,进行成脂诱导分化,10 d 后进行油红O 染色。分离出的前体脂肪细胞经诱导可产生大量脂滴(图2B)。结果表明从绵羊皮下脂肪组织中成功分离出前体脂肪细胞,可用于后续研究。
图1 HOXC8 基因CpG 岛预测结果
图2 体外培养的绵羊前体脂肪细胞
2.3 绵羊HOXC8启动子区和第1 外显子区的BSP 结果对亚硫酸氢盐处理后的DNA 进行PCR 扩增。HOXC8启动子区扩增产物的长度约305 bp(图3A)。HOXC8第1 外显子区扩增产物的长度约357 bp(图3B),均为单一明亮条带,与预期产物大小一致。
图3 BSP 处理后HOXC8 启动子区和第1 外显子区扩增产物
2.4HOXC8在绵羊前体脂肪细胞分化过程中的表达趋势 如图4 所示,HOXC8mRNA 的表达量在绵羊前体脂肪细胞分化前极显著高于分化后;分化第6 天HOXC8mRNA 的表达量显著高于其他5 个时间点,但与分化前相比表达水平仍极低。结果说明HOXC8可能主要在前体脂肪细胞分化前发挥作用。
2.5 绵羊HOXC8启动子区和第1 外显子区甲基化水平检测 因为在绵羊前体脂肪细胞分化的第0 天和第2 天HOXC8的表达差异极显著(图4),故本研究选择在分化的第0 天和第2 天检测HOXC8启动子区和第1 外显子区的甲基化水平。
图4 HOXC8 在绵羊前体脂肪细胞分化过程中的表达趋势
HOXC8基因启动子区包含38 个CG 位点,根据测序数据绘制成甲基化图谱(图5)。结果显示分化第0 天有8 个位点发生甲基化,分化第2 天有6 个位点发生甲基化。HOXC8第1 外显子区包含32 个CG 位点,根据测序数据绘制成甲基化图谱(图6)。结果显示分化第0 天有10 个位点发生甲基化,分化第2 天仅有4个位点发生甲基化。虽然都表现为较低的甲基化水平,但在分化第0 天甲基化水平显著高于第2 天。由图7 可见,HOXC8基因启动子区CG 位点的甲基化水平在分化第0 天和第2 天差异不显著,说明绵羊前体脂肪细胞的分化不受HOXC8启动子区甲基化的调控;比较同一分化时期HOXC8启动子区和第1 外显子区甲基化水平发现,第1 外显子区甲基化水平都极显著高于启动子区甲基化水平(P<0.001),说明绵羊HOXC8第1 外显子区甲基化水平调控前体脂肪细胞的分化。
2.6 绵羊HOXC8第1 外显子区甲基化水平与其mRNA 表达丰度的线性回归分析 由图8 可知,HOXC8第1 外显子区DNA 甲基化水平与表达水平呈高度正相关(r=0.994,P<0.000 1),说明在绵羊前体脂肪细胞分化过程中HOXC8第1 外显子区甲基化水平正调控其mRNA 的表达。
3 讨 论
图5 HOXC8 启动子区的DNA 甲基化图谱
图6 HOXC8 第1 外显子区的DNA 甲基化图谱
油红O 可对细胞内的脂滴进行着色,清楚地显示脂肪细胞形态和脂滴分布,便于分析细胞内甘油三酯沉积情况。猪背最长肌来源的肌内前体脂肪细胞在分化第8 天时用油红O 染色形成大量脂滴[17]。本研究采用胶原酶法分离获得的绵羊前体脂肪细胞呈梭形,诱导分化后细胞内产生大量脂滴。
图7 HOXC8 启动子区和第1 外显子区的甲基化水平
图8 HOXC8 第1 外显子区甲基化水平和mRNA表达水平回归分析
HOXC10在绵羊骨髓间充质干细胞成脂分化过程中mRNA 的表达量随着时间的推移逐渐下降[18]。在诱导ADSCs 成脂分化过程中,HOXC8的表达量在脂肪形成过程中呈下降趋势[8]。本研究也发现,HOXC8mRNA 表达量在前体脂肪细胞分化前显著高于分化后,说明HOXC8可能主要在绵羊前体脂肪细胞分化前发挥生物学功能。
本研究中绵羊前体脂肪细胞分化过程中HOXC8mRNA 的表达不受其启动子区甲基化的调控。在猪前体脂肪细胞分化过程中,硫氧还蛋白结合蛋白(Thioredoxin-Interacting Protein,TXNIP)启动子区甲基化水平基本为0,且不随表达量的升高而变化,说明TXNIP的表达可能不受其启动子区甲基化的调控[19],与本研究结果一致。小鼠脂肪细胞分化前HOXA5启动子区甲基化水平显著低于诱导分化第4 天,且与其表达量呈负相关[20],与本研究中前体脂肪分化不受HOXC8启动子区甲基化调控相矛盾,这可能与物种或选择分化时间的不同有关。关于在绵羊前体脂肪细胞诱导分化2 d后HOXC8启动子区的甲基化水平有待于进一步研究。
许多研究证实,DNA 甲基化可以抑制或沉默基因的表达[21-22]。但也有报道显示在基因不同位置的DNA甲基化可以对基因表达产生相反的作用。在脊椎动物中,当甲基化位于基因编码区时,不仅没有抑制基因的表达,相反还起到促进作用[23]。人类全基因组关联分析显示,基因编码区的DNA 甲基化与基因表达呈正相关[24]。本研究也发现,在绵羊前体脂肪细胞分化过程中,HOXC8第1 外显子区甲基化水平正调控HOXC8mRNA 的转录。
4 结 论
本研究结果表明,HOXC8可能主要在绵羊前体脂肪细胞分化前发挥作用,在分化过程中HOXC8在转录水平的表达受第1 外显子区甲基化的正调控。