孕早期血清miR-125b、miR-124检测在唐氏综合征产前筛查中的价值分析

曾芳，何凤萍，杨祥康

(1.惠州市第六人民医院检验科，广东 惠州 516211；2.舟山市妇女儿童医院产前诊断实验室，浙江 舟山 316000)

唐氏综合征(down syndrome，DS)又称为21三体综合征，主要表现为智力低下、特殊面容、生长发育障碍，可伴发多系统疾病。据调查，新生儿DS发病率为1/600～1/800[1]。我国每年约有3万例DS患儿出生，其发病率位列各种出生缺陷的第三位[2]。孕期针对胎儿DS进行筛查和诊断是降低DS患儿出生率，提高优生优育水平的关键手段，目前学术界公认的DS筛查方法为传统的血清学DS筛查及无创产前基因检测[3]，其中血清学产前筛查由于具有安全、简便、高效的优势而被作为临床常规筛查手段。但在产前筛查中，血清学DS筛查存在的孕早期检出率低等问题越来越受到关注，据统计，传统血清学DS筛查的检出率仍只能达到约60%[4]。因此，近年来，超声检测胎儿颈项透明层(nuchal translucency，NT)厚度、高通量测序技术检测母体外周血胎儿游离DNA(cell-free fetal DNA，cff DNA)等辅助手段被用于提高DS筛查的检出率，但这些检测方法仍然无法代替传统的羊水细胞染色体核型分析[5]。微小RNA(microRNAs，miRNAs/miR)是近年来学术界广泛关注的表观遗传学血清标志物。有研究[6]结果显示DS的发生和发展与多种miRNAs的异常表达有关，但miRNAs能否作为孕早期血清标志物用于辅助筛查诊断DS仍存在争议。基于此，本研究选取了70例经传统血清学筛查或胎儿NT检测提示DS高风险的孕妇作为研究对象，分析孕早期血清miR-125b、miR-124水平在DS产前筛查中的价值。现报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2014年1月至2019年1月在舟山市妇女儿童医院接受孕早期(10～14周)二联血清学唐筛检查及胎儿颈项透明层(NT)检查，至少一项结果提示DS胎儿高风险的70例孕妇，经羊水穿刺取羊水细胞培养和染色体核型分析，35例确诊为DS胎儿孕妇作为病例组，35名为正常妊娠孕妇作为对照组。两组孕妇均签署知情同意书自愿参与本研究，研究方案经医院医学伦理委员会审核通过。病例组孕妇经本人和家属同意后终止妊娠。排除标准：双胎或多胎妊娠孕妇；通过辅助生殖手段受孕者；具有DS家族遗传史或既往DS患儿分娩史的孕妇；合并恶性肿瘤、重度高血压、糖尿病及慢性心脑血管病的孕妇。

1.2 观察指标和检测方法

1.2.1 基线资料 通过查阅病历及生育手册收集两组孕妇的年龄、孕周、孕次、产次、体质指数(body mass index，BMI)、有害物质接受史、吸烟史、服用叶酸时间短于3个月比例等基线资料。

1.2.2 血清学筛查 孕早期留取受检孕妇空腹外周血3 mL，离心后取血清置于-20 ℃保存，72 h内送实验室检测。采用ACCESS2 型化学发光免疫分析仪(美国Beckman Coulter公司)对血清妊娠相关血浆蛋白A、人绒毛膜促性腺激素水平进行检测。采用Muldeale软件根据血清学指标检测结果及孕妇的年龄、体重、孕周、孕产史等变量计算DS风险值，当风险值≥1∶270时判定为高风险，记为血清学筛查阳性。

1.2.3 胎儿NT筛查 采用iU22B多普勒超声仪(美国Philips公司)对胎儿NT厚度进行检测，超声探头频率设定为2.0～5.0 MHz，检查时将胎儿的头部和上胸部的超声图像放大，于胎儿颈部皮肤高回声带深部寻找NT，其在超声图像显示为低回声和无回声，于NT最宽处对其与皮肤的垂直光带距离进行测量。每例胎儿均重复检测3次，取其中最大值作为测量值，当NT>2.5 mm时判定为DS高风险，记为NT筛查阳性。

1.2.4 血清miR-125b、miR-124相对表达量 孕早期留取受检孕妇空腹外周血2 mL，离心后取血清置于-18 ℃待测。采用Trizol reagent RNA提取试剂盒(美国Invitrogen公司)对血清样本总RNA进行提取，采用7 500型荧光定量聚合酶链式反应(PCR)仪(美国ABI公司)应用实时聚合酶链式反应(RT-PCR)法对血清miR-125b、miR-124相对表达量进行检测，以U6为内参，RNA催化合成采用cDNA：PrimerScriptTMRT试剂盒，RNA扩增采用SYBR Premix Ex TaqTMqRT-PCR试剂盒，待测RNA和内参的PCR扩增引物序列见表1，反应体系为SYBR Premix Ex TaqTMⅡ(2×)5 μL、PCR Forward Primer 0.4 μL、Uni-miR qPCR Primer 0.4 μL、ROX Reference Dye Ⅱ 0.2 μL、cDNA模板 1μL、dH2O 3 μL，共10 μL。反应条件为：50 ℃ 5 min，95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 40 s，溶解曲线绘制：95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，85 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，共反应40个循环。采用熔解曲线和琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行分析，采用Opticon Monitor软件计算循环阈值(Ct)，采用2-△△Ct法计算待测RNA的相对表达量，计算公式为：△Ct=Ct目标基因-Ct内参基因，△△Ct=△Ct检测样品-△Ct基准样品。

表1 miR-125b、miR-124及内参的PCR扩增引物

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 两组孕妇基线资料的比较

两组孕妇年龄、孕周、孕次、产次、BMI比较，差异均无统计学意义(P>0.05)，病例组孕妇有害物质接触史、吸烟史及服用叶酸时间短于3个月比例高于对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表2。

2.2 两组孕妇血清学和胎儿NT筛查结果及血清miR-125b、miR-124相对表达量的比较

病例组孕妇的血清学筛查阳性率及血清miR-124相对表达量高于对照组孕妇，血清miR-125b表达量低于对照组孕妇，差异均有统计学意义(P<0.05)。两组孕妇胎儿NT筛查阳性率比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表2 两组孕妇基线资料的比较

表3 两组孕妇血清学和胎儿NT筛查结果及血清miR-125b、miR-124相对表达量的比较

2.3 血清学筛查、胎儿NT检测及血清miR-125b、miR-124水平在DS诊断中的价值分析

ROC曲线分析结果显示，孕早期血清学筛查及血清miR-125b、miR-124水平诊断DS的AUC均有统计学意义(P<0.05)，其中以血清miR-124a水平的AUC最高，为0.906，在Cut-off值下灵敏度和特异度分别为0.657、0.971，而孕早期胎儿NT检测诊断DS的AUC无统计学意义(P>0.05)。见表4、图1。

表4 孕早期血清学筛查、胎儿NT检测及血清miR-125b、miR-124水平检测诊断DS的ROC曲线分析

3 讨论

根据相关研究[7]报道，血清学筛查在孕早期对DS的检出率相对较低，而在孕中期可达到超过75%。有一些学者提出了采用孕早中期阶段性序贯血清学DS筛查来提高诊断灵敏度，减少漏筛病例[8]。也有研究[9]显示，虽然DS早中孕期联合血清筛查方案优于单独早孕期血清筛查方案，但其诊断效率的差异并无有统计学意义，而且对于开放性神经管缺陷等其它先天畸形的筛查效果不佳。因此，在近年来的研究中，学者们一般主张将血清学筛查与超声胎儿NT检测联合作为孕早期的DS筛查手段[10]，学术界普遍认为，这两种方法不能互相取代，联合应用可在一定程度上提升诊断的准确性[11]，故临床上也将这两种筛查方法之一提示高风险作为有创性诊断羊水穿刺的指征。本研究结果显示，正常孕妇在孕早期胎儿NT检测的阳性率与DS胎儿孕妇的差异并不具有统计学意义，假阴性率较高是导致该方法诊断DS效率较低的主要因素。分析其原因，可能是孕早期DS胎儿超声软指标表现比较多样，胎儿的超声表现一般以NT增厚、鼻骨发育不良、鼻骨缺如、颈后皮肤(NF)增厚为主，少数胎儿可伴有第5指中节指骨发育不良、股骨肱骨短、肾盂分离、心室点状强回声、草鞋足等遗传学超声特征,这些复杂的超声特征易造成临床误诊[12]；同时，相关研究[13]结果显示，在未经强化培训和学习的情况下，不同超声科医师对胎儿NT的检测数据偏倚较大，其原因可能与测量时的胎儿体位及测量游标位置不稳定有关。因此，虽然血清学筛查和胎儿NT检测能够对DS筛查中发挥积极的作用，但对于辅助诊断DS的作用明显不足，特别是可导致不必要的有创检测及一定程度的假阳性率。

虽然DS的发病机制尚未完全阐明，但已形成了染色体配对重组异常、纺锤体组装检查点异常、端粒长度减少、黏连蛋白异常、卵母细胞镶嵌选择模型、维持DNA稳定性相关基因单核苷酸多态性等多种病理机制观点[14]。基于这些观点，母血中游离miRNAs作为一种新的非侵入性表观遗传学早期标志物被引入DS产前诊断领域，其中，针对miR-125b、miR-99a、let-7c、miR-155、miR-802等5种人类21号染色体21q21.1-21.3位点转录miRNAs的研究最多，这5种miRNAs参与了DS的可变表型，但DS胎儿全基因组miRNA表达的变化尚待确定[15]。miR-125b是一种广受关注的DS 标志物，具有调节B细胞反应的作用，在DS患者人群中，miR-125b在其扁桃体记忆B细胞和血浆细胞中的表达均出现上调[16]；在DS胎儿的胎盘组织中，miR-125b表达量也会出现上调，能够对胎盘发育相关基因发挥调控作用，从而参与DS的胎盘受损及相关妊娠病理过程[17]。进一步的研究[18]结果显示，DS患者外周血miR-125b的高表达可能与其神经病理病变及先天性心脏病、白血病、低实体瘤等合并症的发生率有关。然而，针对DS胎儿及其母体孕期血清miR-125b水平的研究结果则与上述结果存着明显的分歧：例如，有研究[19]报道称，孕妇中的细胞外miR-125b水平高于非孕妇，但其相对表达量在整倍体胎儿和DS胎儿之间无显著的差异；同一研究团队发表的报道[20-21]甚至得出了完全相悖的研究结论。研究结果可见，DS胎儿母体在孕早期出现了外周血miR-125b表达的下调，这种现象在先天性心脏病胎儿母体[22]和子痫前期孕妇[23]中也可观察到。相关基础研究[24-26]也证实，较高的miR-125b水平可对心肌细胞、视网膜神经节细胞、成骨细胞的结构和功能发挥保护作用。本研究结果显示，DS胎儿母体孕早期血清miR-125b相对表达量下降，对于诊断DS具有一定的辅助作用。因此，孕早期母体血清miR-125b表达下调可能是DS胎儿母体孕期的重要病理机制之一，可能参与了孕期DS胎儿的器官损害过程，其确切机制尚需要相关研究予以进一步讨论。

近年来关于miR-124与DS的研究并不多见，但Choi等[27]研究提示，miR-124在海马神经发育中发挥着关键的作用，DS患者脑部关键区域中的miR-124表达异常可能促进了其认知缺陷的发生；其他研究[28-30]还报道了miR-124的过表达可提升胎盘滋养层细胞的增殖与侵袭能力、抑制干细胞成骨分化能力、影响神经干细胞增殖和分化。因此，孕早期母体血清miR-124的过表达可能提示着胎儿DS病变的神经病理过程，从而反映DS发病风险。本研究结果显示，DS胎儿母体孕早期血清miR-124相对表达量上升，血清miR-125b、miR-124水平诊断DS的特异度较高，可用于弥补血清学筛查和胎儿NT检测在DS筛查诊断中的特异性不足问题，这为采用孕期母体血清miRNAs检测方法筛查诊断DS提供了有益的临床思路。

综上，DS胎儿母体在孕早期可出现血清miR-125b表达下调和血清miR-124表达上调，这两种标志物在筛查诊断DS中具有较高的特异度，临床医师可考虑将其与传统筛查方案进行联合应用，以提高孕早期DS筛查的准确性。