不同浓度PEBP凝胶对大鼠子宫内膜纤维化的抑制作用

党家凤，谌伦华，张娟，沈成义，王冰

(川北医学院，1.临床医学系；2.附属医院妇产科；3.形态学研究所；4.影像四川省重点实验室；5.基础医学院化学教研室，四川 南充 637000)

宫腔粘连，通常是在子宫刮宫术后子宫内膜基底层受到创伤所致[1]，以子宫内膜纤维化为主要特征，可导致经量减少、流产，甚至不孕。目前，宫腔粘连的主要治疗方法包括术后宫腔内放置气囊、Foley导管、宫内节育器、新鲜或冻干羊膜、硅胶片及宫腔内注射透明质酸钠或自体交联透明质酸钠[2-9]。然而，大多数固体装置无法根据不同形状和大小的子宫腔发生适应性改变[7]，进而导致防止子宫边缘位置粘连的成功率较低。此外，Foley导管甚至还会增加子宫内膜组织的压力，阻碍子宫内膜的再生，诱发子宫内膜坏死[10]。透明质酸钠或自交联透明质酸钠可适应不同形状和大小的子宫腔，但却无法长期有效。为此，设计并制备既可通过物理阻隔防止组织粘连，又可抑制成纤维细胞增殖的可被机体吸收的聚乙二醇-b-聚L-苯丙氨酸 [poly(ethyleneglycol)-b-poly(L-phenylalanine)，PEBP] 聚合物凝胶有一定的应用前景，以用于预防损伤后子宫内膜纤维化。本研究初步探讨不同浓度PEBP凝胶对大鼠子宫内膜损伤所致纤维化的抑制作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 雌性Sprague-Dawley(SD)大鼠24只，鼠龄7～8周，体重220～240 g，由川北医学院动物实验中心提供。实验操作均在川北医学院实验动物中心进行[SYXK(川)2013-076]，对动物的处置要求符合相关动物伦理学。饲养条件：室温22～26 ℃，湿度40%～70%，损伤术后单笼饲养，可自由获取食物。

1.1.2 手术材料 无菌干纱布(40 mm×50 mm)、医用脱脂棉、一次性注射器、4-0可吸收缝线、6-0可吸收缝线、血管钳、剪刀、持针器、镊子、手术刀柄、手术刀片、止血钳等(均采用高压蒸汽法灭菌)。

1.1.3 主要试剂 脂多糖(lipopolysaccharide，LPS，Sigma)、苏木素伊红(hematoxylin and eosin，HE)染色试剂盒(碧云天)、MASSON染色试剂盒(碧云天)；转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)单克隆抗体(Abcam)。

1.2 实验方法

1.2.1 实验分组 将24只SD雌性大鼠随机分为4组(B、C、D、E组)，每组各6只。A组：模型组(因大鼠为“Y”字型双子宫，造模无凝胶侧随机抽取6只子宫组织作为模型组)；B组：PEBP浓度0 mg/mL；C组：PEBP浓度8.125 mg/mL；D组：PEBP浓度16.25 mg/mL；E组：PEBP浓度32.5 mg/mL。

1.2.2 实验造模 如研究[11]所述，采用刮宫加感染双重损伤法建立大鼠宫腔粘连模型。将SD雌性大鼠准确称重后，腹腔注射戊巴比妥钠(0.69 mg/kg)麻醉，腹部备皮、仰卧位固定于手术台上，常规消毒、铺巾，暴露腹部手术区域。于耻骨联合上1.5 cm 沿腹正中线向上做3 cm切口，逐层打开腹腔，暴露子宫，置于无菌巾上，双侧子宫在宫颈上方约5 mm作横行切口，长约4 mm，对大鼠行刮宫术，宫腔四壁出现粗糙感时停止刮宫，6-0可吸收线缝合切口，将制作好的LPS棉线(4号医用无菌手术线浸泡于6 mg/L的LPS生理盐水中，4 ℃放置24 h)置入已行刮宫术的宫腔，生理盐水冲洗腹腔，0.3 mL不同浓度的PEBP凝胶随机注入大鼠的一侧子宫，对侧子宫注入0.3 mL生理盐水，4-0可吸收线逐层关腹，缝合皮肤，碘伏棉球消毒伤口，48 h后取出LPS棉线。

1.2.3 取材及处理 各组均于术后第14天采用颈椎脱臼法处死实验大鼠，立即剖腹取子宫组织，剔除脂肪及结缔组织后，剪取大鼠子宫组织置于10%中性福尔马林中固定24 h，常规石蜡包埋切片。

1.2.4 组织染色及图像分析 高倍显微镜下观察并选取视野。(1)HE染色观察创伤组织愈合情况；(2)Masson染色观察子宫内膜纤维化程度；(3)免疫组化染色检测子宫内膜TGF-β1表达水平。采用Image-Pro plus图像处理软件收集各组数据。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 各组大鼠子宫内膜愈合状况

术后14 d，各组大鼠子宫横切面HE染色后均见丰富的内膜腺体开口，见图1。各组间的单位面积腺体计数无明显差异(A=27.553±19.702，B=31.625±21.714，C=24.335±15.962，D=26.500±22.346，E=31.600±19.586，F=0.467，P=0.760)，损伤组织愈合情况良好，大鼠子宫内膜因机械损伤后，诱发炎性反应，巨噬细胞的数量增多，在HE染色后大鼠子宫内膜可见巨噬细胞(图1中箭头所指为巨噬细胞)。

2.2 各组大鼠的单位面积纤维化比较

各组大鼠的单位面积纤维化程度分别为A=54.001±8.171、B=47.699±10.148、C=41.187±10.076、D=36.121±8.560、E=27.173±10.364(F=21.339，P<0.001)。实验组与模型组相比，宫内植入PEBP凝胶可显著降低损伤所致子宫内膜纤维化程度，且纤维化程度随凝胶中PEBP含量增加而降低。见图2。

2.3 各组大鼠TGF-β1表达结果比较

各组大鼠子宫内膜TGF-β1表达情况分别为A=0.051±0.006、B=0.067±0.005、C=0.063±0.011、D=0.057±0.017、E=0.046±0.012(F=3.119，P=0.039)。实验组与模型组相比，PEBP含量为0的B组子宫内膜组织TGF-β1的表达显著升高(P<0.05)，PEBP含量最高的E组子宫内膜组织TGF-β1的表达显著下降(P<0.05)，C、D两个PEBP凝胶组子宫内膜组织TGF-β1表达与对照组无显著差异(P>0.05)。四个凝胶组间TGF-β1表达对比可见，TGF-β1的表达随凝胶中PEBP含量增加而依次降低，见图3。

3 讨论

成纤维细胞是机体损伤的主要修复细胞，而成纤维细胞过度生长是纤维化形成的主要原因[12]。前期研究[13]发现，L-苯丙氨酸(L-phenylalanine，L-Phe)可以通过调控细胞膜表面钙离子敏感受体(calcium sensitive receptor，CaSR)实现抑制成纤维细胞过度增殖的作用。为此，本研究设计并制备了可以通过肽键释放L-Phe的PEBP凝胶以用于预防损伤导致的大鼠子宫内膜纤维化，并探讨凝胶中PEBP含量对纤维化抑制作用的影响。

PEBP凝胶应用于损伤子宫中可有效抑制损伤导致的子宫内膜纤维化，且纤维化程度随凝胶中PEBP浓度的增加而降低，说明PEBP/PEG凝胶中可以抑制纤维化发生的有效成分是PEBP，这可能是由于PEBP嵌段聚合物中的聚L-苯丙氨酸链段，植入体内肽键被水解或酶解后，可释放出抑制成纤维细胞增殖的L-Phe，从而抑制纤维化的发展。此外，与模型组相比，纯PEG的B组子宫内膜组织TGF-β1的表达显著升高， PEBP中PEG链段的分子量为2 kDa，B组不含PEBP的凝胶主要成分为PEG 2000及PEG 400，分子量大于2 kDa的PEG在体内的代谢主要依靠巨噬细胞的吞噬作用，而巨噬细胞也可以分泌TGF-β1，即PEG的应用刺激了TGF-β1的过度表达[14]。值得注意的是，随着凝胶中PEBP含量的增加，大鼠子宫内膜组织的TGF-β1表达依次下降，且应用最高PEBP含量凝胶的E组TGF-β1表达则显著低于模型组。这表明PEBP的应用可以降低组织中TGF-β1的表达。除巨噬细胞之外，成纤维细胞也是TGF-β1的主要分泌细胞，应用PEBP后TGF-β1表达的下降表明PEBP抑制了损伤组织中成纤维细胞的过度增殖。而TGF-β1作为促纤维化因子又可促进纤维化组织的形成，应用PEBP降低TGF-β1的表达可有效缓解损伤导致的组织纤维化。

综上，PEBP/PEG凝胶可以有效抑制损伤导致的大鼠子宫内膜纤维化，源于PEBP对损伤组织中成纤维细胞过度增殖的抑制作用，并通过这一作用调控子宫内膜组织中促纤维化因子TGF-β1的表达实现抑制纤维化的作用。