长链非编码RNA THOR在食管鳞状细胞癌中的表达及作用机制研究

蒲文杰，钟晓武,，徐磊，高川力，李青容，程吉兵，周锡，杨密渊，郭晓兰,

(川北医学院，1.附属医院检验科；2检验系；3.转化医学研究中心，四川 南充 637000)

食管癌(esophageal carcinoma，EC)是全球第8大恶性肿瘤，也是第6大肿瘤死亡原因[1]。2018年全世界新增确诊食管癌患者约572 034人，死于约508 585人，其中近一半发生在中国，且主要以食管鳞状细胞癌(esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)的病理类型出现，其相关死亡率位居恶性肿瘤致死的第四位，是造成人类死亡的主要原因之一[2-4]。近年来，虽然外科手术、放疗、化疗、免疫治疗等治疗方法不断改进，但由于EC发病隐匿且缺乏有效用于EC早期诊断的分子生物标记物，导致EC早期诊断困难，约50%的EC患者在疾病后期或晚期接受诊断时已出现转移[5]。

长链非编码 RNA(long non-coding RNA，LncRNA)是一类长度大于200个核苷酸的非编码RNA，是基因组转录产物中不具有编码蛋白质的基因序列，广泛存在于所有真核生物的细胞核与细胞质中，且在不同组织中表达具有特异性[6]。已有研究表明LncRNA可通过多种形式参与转录调控，如染色质修饰、染色体沉默、基因组印记等多种生物学功能，进而参与调节细胞增殖和凋亡、细胞周期、细胞代谢等生命活动过程[7-10]。LncRNA的多功能的生物学特征，决定了其异常表达将与各类疾病特别是恶性肿瘤密切相关。睾丸相关的高保守的致癌长非编码RNA (testis-associated highly-conserved oncogenic long non-coding RNA，LncRNA THOR)属于基因间型的LncRNA，具有序列保守的特性且主要表达于正常睾丸和肿瘤组织中。研究发现LncRNA THOR能够促进肾癌细胞和骨肉瘤细胞在体内外的增殖生长。还能通过提高鼻咽癌细胞干性，降低鼻咽癌细胞对顺铂的敏感性[11-13]。LncRNA THOR还可以直接与胰岛素样生长因子2 mRNA 结合蛋白1 (insulin-like growth factor 2 mRNA binding protein 1，IGF2BP1)结合，并调控胰岛素样生长因子2 (insulin-like growth factor 2，IGF2)、胶质瘤相关癌基因同系物1(gliom-associated oncogene homolog 1，GLI-1)与MYC等下游靶基因，最终影响肿瘤发生的进展。然而，LncRNA THOR在ESCC中表达情况及其可能的作用机制尚未有报道。本研究旨在分析ESCC中LncRNA THOR的表达情况，并且进一步探讨其在ESCC中的潜在功能。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 组织 收集川北医学院附属医院胸外科食管癌病例20例，所有病例均由经验丰富的病理医师确诊，组织标本经手术离体30 min内剪取适量肿瘤中心组织，同时剪取距离切缘5 cm的癌旁正常食管上皮组织，立即浸在装有RNAlater solution 的EP管中放入冰盒中运输，置于-80 ℃保存。该项研究符合《赫尔辛基宣言》，在获得伦理审查委员会批准及每一位患者知情同意的前提下进行组织标本及患者信息的收集。

1.1.2 细胞株 人食管鳞状细胞癌细胞系TE1、EC109、KYSE150以及正常食管鳞状上皮细HET-1A由川北医学院转化医学研究中心提供。

1.2 方法

1.2.1 UALCAN分析 UALCAN (http://ualcan.path.uab.edu/index.html)是一个基于癌症基因组图谱(TCGA)数据库，具备在线分析目的基因表达、相关性、预后分析和挖掘等功能的网站。首先登陆UALCAN，点击TCGA analysis，输入Gene names为LncRNA THOR，在TCGA dataset选择Esophageal carcinoma，然后点击Expression，分析LncRNA THOR在TCGA数据库中食管癌不同亚组中的表达情况。

1.2.2 RNA提取 提取细胞/组织总RNA 时，先预冷PBS清洗2～3遍，加入1 mL Trizol裂解细胞15 min，待贴壁细胞完全脱落后，移至2 mL EP管。使用美国Thermo Fisher公司核酸浓度检测仪检测RNA浓度和吸光度(A值)，再应用德国Roche公司Transcriptor FirstStrand cDNA Synthesis试剂盒将RNA逆转录成cDNA。

1.2.3 qRT-PCR 首先通过生工生物工程(上海)股份有限公司合成目的基因LncRNA THOR、GLI-1、MYC和内参基因GAPDH的基因引物序列，见表1。再利用qRT-PCR将获取的组织、细胞cDNA分别进行mRNA检测。扩增反应总体积为20 μL，包括Fast SYBR Green Master mix 10 μL，上、下游引物各0.2 μL，cDNA模板1 μL，加入灭菌灭酶ddH2O至总体积20 μL，每个样本上3个复孔。qRT-PCR反应结果数据采用德国Roche公司Light Cycler 96系统分析，按照公式2-ΔΔCT计算组织和细胞中目的基因的mRNA相对表达量。

表1 LncRNA THOR、GLI-1、MYC和内参基因GAPDH的基因引物序列

1.2.4 siRNA实验 两条不同LncRNA THOR siRNA序列，5′-CUACAUGGGUAAUCAAUAU-3′(si-LncRNA THOR-1)，5′-CUAUGGUGUGUGAACAUUA-3′(si-LncRNA THOR-2)及其对照序列购于生工生物工程(上海)股份有限公司，Viafect转染试剂购于Promega公司。将处于对数期增殖的食管癌细胞按3×106个/孔均匀平铺在六孔板，细胞生长密度达到50%时，开始进行转染。更换为不含胎牛血清和双抗的DMEM培养基，把si-NC(对照)、si-LncRNA THOR-1、si-LncRNA THOR-2和Viafect转染试剂，加入食管鳞状细胞癌细胞系TE1中，在37 ℃、5% CO2的培养箱培养48 h后检测转染效率。

1.2.5 CCK-8实验 取对数生长期食管癌TE1细胞，经胰蛋白酶-EDTA消化液消化后制成单细胞悬液，计数细胞，调整浓度为5×104/mL，96孔板每孔接种100 μL细胞悬液，设置4个平行组，每组设3个复孔和一个空白孔(只加100 μL培养基)，待细胞贴壁后，继续培养0 h、12 h、24 h、48 h。每个时间点取出一组细胞，每孔加入10 μL CCK8试剂，细胞培养箱内孵育1 h后放入酶标仪于450 nm波长处测定吸光度值(A)，以时间(h)为横坐标，A为纵坐标绘制生长曲线，实验重复3次。

1.2.6 划痕试验 转染细胞传代至6孔板内，用含10%胎牛血清的DMEM完全培养基培养，待细胞单层融合度达90%左右时用10 μL枪头垂直桌面在六孔板孔内划井字，完成后用PBS洗去孔内的悬浮细胞，选取划痕整齐的部位拍照，并标记拍照点，用含10%胎牛血清的DMEM完全培养基继续培养，划痕12 h、24 h、48 h后，观察选取位置划痕宽度变化并拍照保存。

1.2.7 Western blot 使用RIPA试剂裂解转染成功后的肿瘤细胞，冰上孵育至完全裂解，4 ℃、12 000 rpm，离心30 min，采用BCA法蛋白浓度测定试剂盒(美国Thermo Fisher公司)检测蛋白浓度。配置10%凝胶，按照总蛋白40 μg，总体积10 μL上样，恒压80 V电泳至浓缩胶和分离胶交界处时，调整电压至120 V继续电泳至样本迁移至凝胶末端处。在250 mA恒流下转膜90 min，5%脱脂奶粉室温封闭60 min，PBST洗PVDF膜3次，5 min/次，按说明书稀释一抗GLI-1(兔源，货号：ET1702-85)、MYC(鼠源，货号：EM1902-38)，抗体购自杭州华安生物技术有限公司。将PVDF膜平整放置于孵育盒中，4 ℃振揺过夜。PBST洗PVDF膜3次，5 min/次，孵育对应的兔源/鼠源二抗(杭州华安生物技术有限公司)60 min后避光显影。

1.3 数据分析

2 结果

2.1 LncRNA THOR与EC患者临床数据的相关性分析

利用UALCAN数据库在线分析LncRNA THOR的表达情况，分别从EC的LncRNA THOR在不同样本类型、肿瘤分期、肿瘤分级、性别、年龄、体重、种族、吸烟、肿瘤亚型等几个方面进行统计分析，结果如图1所示：LncRNA THOR在EC患者的表达显著高于正常人，肿瘤分期为II和 III期，肿瘤分级为II和III级，年龄段为40～80岁，种族为高加索人和亚洲人的食管腺癌(esophageal adenocarcinoma，EAC)和ESCC男性患者也显著高表达。

2.2 LncRNA THOR在ESCC癌组织和细胞的表达都升高

通过qRT-PCR检测20例ESCC癌组织和癌旁组织的LncRNA THOR 表达，发现ESCC癌组织中LncRNA THOR 表达水平对比癌旁组织显著升高(P<0.05)(图2)。实验结果与TCGA的数据一致都印证LncRNA THOR在ESCC中高表达，暗示LncRNA THOR可能是ESCC的促癌基因。

通过qRT-PCR检测ESCC细胞系TE1、 EC109和 KYSE150和正常食管上皮细胞HET-1A中 LncRNA THOR 的表达情况，结果显示TE1和EC109中LncRNA THOR 表达水平对比HET-1A明显上调(P<0.05)(图3)。

2.3 siRNA-LncRNA THOR敲降TE1细胞中LncRNA THOR的表达水平

将化学合成2个靶点siRNA (siRNA-LncRNA THOR-1和siRNA-LncRNA THOR-2) 转染TE1细胞后，LncRNA THOR的表达量均降低(P<0.01) (图4)。结果表明，本实验成功构建LncRNA THOR敲降的TE1细胞。

2.4 敲降LncRNA THOR抑制TE1细胞增殖及迁移

为了探究LncRNA THOR对TE1细胞的影响，在TE1细胞中敲降LncRNA THOR以检测其对TE1 细胞的影响。si-LncRNA THOR-1和si-LncRNA THOR-2转染TE1细胞后，通过CCK8实验结果证实实验组的细胞增殖受到抑制(图5)，差异具有统计学意义。划痕实验显示(图6)，与无意义对照组(si-NC)相比，2个靶点(si-LncRNA THOR-1、si-LncRNA THOR-2)进行转染的TE1细胞在12 h、24 h、48 h几个时间位点均表现为迁移能力明显受到抑制。结果表明，敲降LncRNA THOR能够抑制TE1细胞增殖及迁移能力。

2.5 敲降LncRNA THOR下调TE1细胞中GIL-1和MYC mRNA和蛋白质的表达水平

siRNA-LncRNA THOR-1和siRNA-LncRNA THOR-2转染TE1细胞后，与无意义转染对照细胞(si-NC)相比， GLI-1和MYC mRNA和蛋白质表达水平均下降(P<0.05)(图7-图8)。结果表明，敲降LncRNA THOR能够显著下调 TE1 细胞中GLI-1和MYC的mRNA及蛋白的表达水平。

3 讨论

ESCC是一种常见的恶性肿瘤，其发病隐匿，早期诊断困难是食管癌发病率居高不下的主要原因；而晚期发现的食管癌患者往往已经失去手术治疗的最佳时机，放化疗的预后均令人堪忧，导致死亡率极难下降。因此，需要寻找ESCC的早期诊断标志物和治疗靶点。研究表明，ESCC的发生发展与lncRNA密切相关，许多lncRNA参与了ESCC的疾病进程。Yao等[14]报道发现MALAT-1的上调与ESCC患者的生存率降低有关。抑制MALAT-1可影响ESCC细胞凋亡、迁移/侵袭、集落形成和细胞周期阻滞等。HOTAIR通过诱导启动子区组蛋白H3K27甲基化，从而降低WIF-1的表达，激活Wnt/catenin信号通路参与ESCC 细胞的增殖和侵袭[15]。LncRNA THOR是近年来新发现的一种非常保守的长非编码RNA，具有睾丸组织特异性，并广泛存在于人类多种肿瘤组织中。已经有研究报道LncRNA THOR能够在基因水平调控多个肿瘤的增殖，LncRNA THOR在肾细胞癌、胃癌、舌鳞状细胞癌、肝癌等多种肿瘤中呈现异常高表达，并在其发生发展中发挥重要作用。然而，LncRNA THOR与ESCC之间的关系尚未研究。为了探究LncRNA THOR和ESCC之间的关系，本研究首先检测了LncRNA THOR在ESCC中的表达情况，再利用siRNA敲降LncRNA THOR后检测ESCC细胞生物学功能的变化。

已有的研究发现肾细胞癌组织标本中LncRNA THOR异常高表达，同样的发现LncRNA THOR在肾细胞癌细胞高表达[12]。体内外研究均证实，靶向沉默LncRNA THOR可以抑制肾癌细胞的生长、增殖和存活，而过表达LncRNA THOR则可以增强细胞的活力和增殖能力。Song等[16]研究发现LncRNA THOR在胃癌中存在高表达的情况。Yang等[17]检测到舌鳞状细胞癌中LncRNA THOR表达上调。体内外研究均证实，敲低LncRNA THOR可以抑制舌鳞状细胞癌细胞的生长、减少克隆形成和诱导G0/G1阻滞，而过表达LncRNA THOR可以促进细胞的增殖和诱导G0/G1期细胞数量增加。Cheng[18]等通过qRT-PCR检测发现，LncRNA THOR在肝癌组织中的表达水平相对比正常肝组织呈显著上调，且LncRNA THOR的表达水平与肝癌复发率和术后生存时间密切相关。该研究进一步证实，沉默LncRNA THOR可显著抑制肝癌细胞的生长、增殖、克隆形成、转移、侵袭等能力。然而，LncRNA THOR的异常表达在ESCC发生发展中的具体机制尚不明确。本研究发现在ESCC癌组织和ESCC细胞系TE1和EC109、中LncRNA THOR表达显著上调，提示LncRNA THOR可能参与ESCC的发生发展过程。 在ESCC细胞系TE1中敲减LncRNA THOR后，通过CCK8和划痕实验发现细胞增殖和迁移能力都受到抑制，表明LncRNA THOR能够参与调节细胞增殖和迁移能力，进而参与ESCC的迁移和侵袭过程。

LncRNA THOR能够与IGF2BP1结合，并调控其依赖基因IGF2 、GLI-1、MYC等，最终影响肿瘤发生的进展。敲除肾癌细胞中的LncRNA THOR可以显著下调IGF2BP1依赖基因IGF2、GLI-1和MYC的mRNA和蛋白质表达水平。而过表达LncRNA THOR则可以上调IGF2BP1依赖基因的mRNA和蛋白质表达水平。因此，在肾癌细胞中，LncRNA THOR通过对IGF2BP1相关依赖基因调控，进一步影响肾癌细胞的细胞生物学表现[12]。LncRNA THOR和IGF2BP1在舌鳞状细胞癌组织中均表达上调，且在mRNA水平上表达呈正相关。LncRNA THOR通过与IGF2BP1相互作用调节IGF2的表达，影响下游信号通路MEK-ERK，进而调控舌鱗状细胞癌细胞的增殖[17]。本研究发现沉默LncRNA THOR后，TE1细胞中GLI-1和MYC的的 mRNA 及蛋白的表达水平都显著降低，提示LncRNA THOR可能通过IGF2BP1相互作用调控GLI-1和MYC的表达水平，参与ESCC细胞的细胞增殖和迁移等，从而调控ESCC发展进展。

综上所述，LncRNA THOR在ESCC中异常高表达，且可能通过IGF2BP1相互作用调控GLI-1和MYC的表达，进而参与ESCC的增殖与迁移过程，但具体调控机制尚需要体内外实验进一步研究证实。本研究同时发现LncRNA THOR在ESCC中扮演着促癌基因的作用，暗示其可能成为ESCC潜在早期诊断分子标志物及治疗靶点。