Th细胞分化特异性转录因子在低体质量先天性心脏病患儿肺血流异常发病机制中的作用

金立臣，温林林，韩喆，张雪杰，姚俊平，宋海龙，陶曙光

先天性心脏病(congenital heart disease，CHD)是婴幼儿常见的缺陷性疾病，对新生儿危害较为严重，存活率相对较低[1]。近年来，随着我国医疗环境的改善及CHD外科技术的不断发展进步，多数患儿经过手术治疗可以得到较好的恢复，预后较好[2]。但对于低体质量婴幼儿，由于其机体免疫力低下、相关器官发育不成熟，病情较为复杂，容易引发免疫功能失调等各种并发症[3]。CHD患儿本身存在一定程度的免疫功能紊乱和低下，即存在一定的Th1向Th2漂移[4]。Th1和Th2之间相互平衡在机体免疫机制中起着重要的作用，而转录因子在T细胞向Th1、Th2亚群进行分化的过程中起着重要的调节作用[5]。而外周血淋巴细胞转录因子T-bet和GATA-3 mRNA分别于Th1和Th2细胞中特异性表达[6]。目前国内外对CHD患者外周血CD4+T细胞亚群的研究主要集中在代表Th1、Th2细胞的细胞因子变化上，对Th细胞分化的特异性转录因子检测和研究甚少[7]。现观察Th细胞分化特异性转录因子在低体质量CHD患儿肺血流异常发病机制中的作用，为其临床诊治提供参考，报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 回顾性分析2016年4月—2018年10月河北省儿童医院心脏外科收治的低体质量先天性心脏病患儿100例的临床资料，根据患儿肺充血情况，分为肺充血组(n=62)和肺缺血组(n=38)。肺充血组男28例，女34例，月龄0.4～12(8.75±0.69)个月；体质量2.85～8.63(5.62±1.54)kg；疾病类型：动脉导管未闭15例，房间隔缺损19例，室间隔缺损28例。肺缺血组男22例，女16例，月龄0.3～12(8.63±0.65)个月；体质量2.78～8.71(5.71±1.52)kg；疾病类型：肺动脉狭窄15例，法洛四联症13例,其他10例。另取同期在医院治疗的其他疾病低体质量患儿50例作为对照组，入院2周内无呼吸道感染，其中男22例，女28例，月龄0.5～12(8.87±0.62)个月；体质量2.69～8.60(5.82±1.68)kg；疾病类型：隐睾15例，鞘膜积液21例，腹股沟斜疝14例。3组患儿性别、年龄、体质量比较，差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。本研究经医院伦理委员会审核批准，患儿家属知情同意书并签署知情同意书。

1.2 病例选择标准 低体质量诊断标准:孕周26～40周,体质量640～246 0 g；所有病例均经体检、辅助检查及心脏彩色超声确诊为先天性心脏病；无肺、肝、肾等脏器严重病史；无严重感染、免疫性疾病史；入院时肝、肾功能均正常。排除合并有免疫缺陷者。

1.3 观测指标与方法 患儿于入院1 d内采集肘静脉血10 ml，加入EDTA 4 ml抗凝，通过聚蔗糖—泛影葡胺方法分离外周血单个核细胞(PBMC)，并分离血浆2 ml备用[8]。

1.3.1 PCR法测定T-bet和GATA-3 mRNA表达[9]：上述PBMC细胞总mRNA采用Trizol法提取，用1.5%琼脂糖凝胶电泳，以确定所提取的mRNA完整性。cDNA合成按照逆转录酶(Promega公司)说明书操作合成。RT-PCR检测由ABI 7300 Real-Time PCR System(美国ABI公司)完成，PCR热循环参数：96℃ 4 min，然后三步反应：94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 30 s，进行40个循环，于每个循环的第三步即72℃ 30 s收集荧光信号，得到Ct值。用Δ Ct值进行统计分析并用RQ值比较各组的mRNA相对表达水平变化。引物设计：GATA-3上游引物5′-TCAGTTGCCTAAGTGGT-3′，下游引物5′-GCACGCTGGTAGCTCATACA-3′；T-bet上游引物5′-GGGACATGGGAGCAGAGA-3′，下游引物5′-TGGCGGGCTGATGGTTAT-3′；内参基因hGAPDH上游引物5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3′，下游引物5′-GAAGATGGTGATGGATTTC-3′。

1.3.2 血浆IL-4和IFN-γ水平测定：上述血浆采用酶联免疫吸附法测定白介素4(IL-4)和γ干扰素(IFN-γ)水平，试剂盒购于上海江莱生物科技有限公司，操作方法严格按照说明书执行。

1.3.3 Th1/Th2细胞水平检测[10]：取上述抗凝血1 ml，按照1∶1的比例与RPMI培养基进行均匀混合，加入ionomyin 1 mg/L 和PMA 25 ng/L作为刺激原，同时将monensin 17 mg/L作为蛋白质转运抑制剂，在5%CO2、37℃条件下培养4 h，对红细胞进行裂解，再加入DPBS缓冲液2 ml进行1次冲洗，将上清液弃去，加入鼠抗人CD3-TC 20 μl和CD8-FITC 20 μl，在室温条件下避光保存45 min；同时做阴性对照和空白对照，再进行1次缓冲液清洗，离心5 min，将上清液弃去。再加入40 g/L多聚甲醛500 μl，固定20 min，离心5 min，将上清液弃去。然后将0.1%皂素缓冲液2 ml进行破膜处理10 min，离心5 min，将上清液弃去。再用大鼠抗人IL-4单抗及大鼠抗人IFN-γ-PE，在室温条件下孵育30 min，将0.1%皂素缓冲液2 ml加入其中，冲洗1次，离心5 min，将上清液弃去。最后用DPBS悬浮细胞(含20 g/L的多聚甲醛)500 μl，通过三色荧光流式细胞仪(NovoCyteTM型，贝克曼库尔特)进行检测。

2 结 果

2.1 3组T-bet、GATA-3 mRNA表达水平比较 与对照组比较，肺充血组和肺缺血组T-bet和GATA-3 mRNA表达均明显降低，且肺充血组患儿降低较肺缺血组更为显著(P<0.05)，见表1。

表1 3组患儿外周血淋巴细胞转录因子T-bet、GATA-3 mRNA表达水平比较拷贝/μg)

2.2 3组血浆IL-4、IFN-γ水平比较 与对照组比较，肺充血组和肺缺血组血浆IFN-γ均明显降低，血浆IL-4明显升高，且肺充血组患儿上述指标变化较肺缺血组更为显著(P<0.05)，见表2。

表2 3组患儿血浆IL-4、IFN-γ水平比较

2.3 3组Th1、Th2细胞百分率及Th1/Th2比率比较 与对照组比较，肺充血组和肺缺血组Th1细胞百分率和Th1/Th2比率均明显降低，Th2细胞百分率明显升高，且肺充血组患儿上述指标变化较肺缺血组更为显著(P<0.05)，见表3。

表3 3组患儿外周血淋巴细胞亚群Th1、Th2细胞百分率比较

2.4 CHD患儿T-bet、GATA-3 mRNA表达水平与血浆IL-4、IFN-γ水平的相关性分析 经Pearson相关性分析显示，CHD患儿T-bet mRNA表达与血浆IL-4呈负相关(r/P=-0.764/0.000)，与IFN-γ水平呈正相关(r/P=1.258/0.005);GATA-3 mRNA表达与血浆IL-4呈正相关(r/P=0.513/0.015),与IFN-γ呈负相关(r/P=-0.525/0.032)。

2.5 CHD患儿T-bet、GATA-3 mRNA表达水平与外周血淋巴细胞亚群Th1、Th2细胞相关分析 经Pearson相关性分析显示，CHD患儿T-bet mRNA表达与Th1百分率呈正相关(r/P=0.685/0.027)，与Th2百分率呈负相关(r/P=-0.985/0.002)；GATA-3 mRNA表达与Th1百分率呈负相关(r/P=-0.652/0.025)，与Th2百分率呈正相关(r/P=0.793/0.011)。

3 讨 论

初始T淋巴细胞接受抗原刺激信号，在共刺激分子和共刺激信号的作用下发生活化，进而在不同条件下分化成调节型T淋巴细胞、Th17型、Th2型及Th1型效应细胞等不同亚型，执行相应的生物学功能[11]。其中Th2细胞主要分泌IL-13、IL-10、IL-6、IL-5、IL-4等细胞因子，主要对B淋巴细胞的活化和增殖进行刺激，同时诱导抗体产生，与机体体液免疫关系较为密切[12]。Th1细胞主要分泌TNF-α、IFN-γ及IL-2等细胞因子，在机体迟发性过敏反应的形成及细胞免疫过程中起着重要的作用[13]。Th1细胞和Th2细胞之间存在相互调节和制约的作用，两者平衡失调会引发不同的免疫紊乱，与其他相关细胞因子致使先天性心脏病等免疫性疾病的发生[14]。本研究通过对各组受试者的外周血淋巴细胞分泌相应细胞因子进行测定，结果显示，CHD患儿外周血淋巴细胞分泌IFN-γ的水平降低，分泌IL-4能力增强，间接反映了CHD患儿Th2型细胞功能亢进，Th1型细胞功能不足。

前体T细胞受到激素、黏附分子、局部微环境、抗原提呈细胞类型及抗原类型和浓度等作用，向Th1和Th2细胞分化，是机体化学信号作用于其表面特异性受体后，通过一系列信号传导，从而诱导相应特征性细胞因子谱进行选择性表达的一个过程[15-16]。近期研究显示，转录因子GATA-3和T-bet分别与Th2细胞因子基因和IFN-γ基因的启动子区结合，对Th2和Th1两类细胞的发育和分化起到中心调节作用[17]。T-bet是转录因子T盒家族的成员之一，可特异性表达于Th1细胞，是其分化的特异性转录因子[18]。有研究显示，对小鼠T-bet基因进行敲除后，小鼠可表现出类似于CHD的病理性免疫改变[19]。GATA-3是锌指蛋白GATA家族的主要成员之一，可以诱导Th前体向Th2细胞分化，是其分化的特异性转录因子[20]。相关研究显示，对小鼠GATA-3进行敲除后，由Th2细胞分化的相应细胞因子水平降低[21]。总之，T-bet对Th1细胞发育起到正调控作用，GATA-3也对Th2细胞的发育起到正调控作用，两者对Th0向Th1/Th2的转化进行调节[22]。另外，GATA-3和T-bet可形成一种自我激活的反馈型调节环路，针对相关特异性转录因子进行调节，进而形成一种动态调节型网络[23]。本研究结果显示，CHD患儿PBMC细胞GATA-3 mRNA表达水平明显升高，T-bet mRNA表达水平明显降低。相关性分析结果进一步证实，CHD患儿T-bet mRNA表达与血浆IFN-γ水平、Th1百分率呈正相关，GATA-3 mRNA表达与血浆IL-4水平、Th2百分率呈正相关。结合相应研究结果，可知GATA-3和T-bet表达平衡失调在Th前体细胞向Th1/Th2细胞分化过程中起着重要调控作用，进而影响血浆IFN-γ、IL-4细胞因子的分泌，参与CHD发病。

综上所述，GATA-3和T-bet表达平衡失调对Th1/Th2细胞的平衡偏移具有重要的调控作用，从而影响血浆IFN-γ、IL-4水平，在CHD的发病机制中起着重要作用。

利益冲突：所有作者声明无利益冲突

作者贡献声明

金立臣：提出研究方向、研究思路，论文撰写，论文审核；温林林：分析试验数据;韩喆：进行文献调研与整理，论文修改；张雪杰、宋海龙：进行统计学分析，设计论文框架;姚俊平：实施研究过程，资料搜集整理；陶曙光：设计研究方案、研究流程