探头式共聚焦激光显微内镜在微创保胆手术中的应用*

汤泊夫，贾语婧，刘 琳，王秋红，韩唯杰，常志恒，党 彤

(内蒙古科技大学包头医学院第二附属医院内蒙古消化病研究所，内蒙古包头 014030)

胆囊结石、胆囊息肉是临床常见的胆囊病变，近年来发病率逐年升高。全球成年人胆囊结石患病率达10.0 %～20.0 %[1]，胆囊息肉患病率也在0.3 %～12.3 %[2]。近年来，腹腔镜胆囊切除术，逐渐成为治疗胆囊良性病变的“金标准”。但是胆囊切除后的并发症，包括血管损伤、胆道损伤、患右半结肠癌风险增加、胆囊切除术后综合征(胃-十二指肠返流、长期腹泻、脂肪泻等)却长期得不到应有的重视[3-5]。1985年，Akiyama等[6]首次报道保胆取石手术，最大限度保留胆囊功能，防止上述并发症出现。随着胆道镜技术不断成熟，出现了内镜微创保胆手术(choledochoscopic gallbladder-preserving surgery，CGPS)治疗胆囊良性疾病[7]。因CGPS术前诊断依靠超声、CT、MRI等影像学结果，无法对胆囊黏膜进行直观的检查，有漏诊胆囊癌前病变甚至胆囊癌的可能，越微小、越早期的病变越容易被漏诊[8]；且CGPS无法获得术后胆囊大体标本，术中冰冻切片等待时间较长，延长手术时间，增加手术风险，取材部位局限，还可能出现漏诊。

探头式共聚焦激光显微内镜(probe-based confocal laser endomicroscopy,pCLE)，是一种新型内镜，可通过多种内窥镜钳道，具备即时的虚拟组织学成像与检测功能,获得放大500～1 000倍的内镜图像,可以实时进行黏膜的细胞层面扫查,有助于进行靶向活检,可显著提高消化系统肿瘤发现率,被誉为“光活检”或“光学切片”[9]。pCLE在诊断消化系统疾病方面已有较多研究，尤其在病变良恶性鉴别、微小病变诊断方面有很高的准确性，具有准确、快速、实时的特点。pCLE在胆囊疾病方面的应用鲜有报道，且尚无保胆手术中应用pCLE的相关研究报道。本研究在CGPS术中应用pCLE进行全胆囊黏膜扫查，无创替代传统游离胆囊病理，结合术前影像学诊断、术后病理诊断与术中pCLE诊断对照，分析pCLE在胆囊疾病诊断方面的准确率，评估pCLE在CGPS中的应用价值；结合病理诊断结果，归纳不同胆囊疾病中pCLE下胆囊黏膜特点，初步建立pCLE胆囊疾病图谱，充实CGPS评估指标，完善CGPS标准。

1 对象与方法

1.1对象 选取2019年9月-2020年7月28例拟行CGPS+pCLE胆囊检查患者。患者中男性7例，女性21例；年龄26～71岁，平均51.75岁。纳入标准：(1)年龄18～80岁；(2)术前腹部彩超、MRI、CT等检查诊断胆囊结石或胆囊良性息肉；(3)同意行CGPS+pCLE；(4)荧光素钠过敏实验阴性；(5)无胆囊急性水肿;(6)胆囊壁厚度<4 mm;(7)胆囊收缩功能大于正常水平的30.0 %。排除标准:(1)胆囊萎缩或瓷性胆囊;(2)怀疑胆囊恶性肿瘤;(3)胆道梗阻;(4)凝血功能严重异常；(5)精神疾病不能配合手术。患者均签署知情同意书，本研究获包头医学院第二附属医院医学伦理委员会批准。

1.2方法

1.2.1pCLE诊断标准 目前尚无胆囊黏膜相关pCLE诊断标准，故参照pCLE相关诊断标准[10]及胆囊黏膜组织学特征，定义了pCLE下不同胆囊状态的诊断标准。具体标准为：(1)正常胆囊黏膜：由单层高柱状上皮细胞、少量基底细胞及特征性的铅笔样细胞组成，无杯状细胞、黑色素细胞，仅胆囊颈部存在真腺体；(2)慢性胆囊炎：可见幽门腺化生及增多的阿-罗氏窦；(3)固醇性息肉：可见大量泡沫样巨噬细胞；(4)腺瘤性腺瘤：可见不规则或绒毛状腺体结构，上皮不规则增厚；(5)腺癌：绒毛状结构紊乱或丧失、细胞形态不规则、细胞边界模糊和不规则血管扩张。参考pCLE相关诊断标准[10]，选择微血管直径(microvessel diameter，MVD)、微血管走行(microvessel run，MVR)、细胞直径(cell diameter,CD)、细胞形态(cell morphology，CM)、细胞间距(cells spacing，CS)、腺体形态(gland morphology，GM)等6个指标，比较各指标在不同状态下胆囊黏膜的差异性，评估各指标在诊断各类胆囊疾病中的意义，量化pCLE在胆囊疾病中的诊断标准。

1.2.2操作过程 (1)术前评估：患者具备行全身麻醉下CGPS的条件，荧光素钠过敏实验阴性(2.0 %，1 mL静脉注射，观察30 min，无心慌、气促、呼吸困难、皮疹等)。(2)手术过程：在包头医学院第二附属医院手术室进行，手术团队包括3名外科医师及1名pCLE医师。术中使用腹腔镜、胆道镜及pCLE。患者全麻仰卧位，采用闭合CO2气腹技术，建立10 mm脐孔置入腹腔镜，腹腔压力维持在10～12 mmHg。剑突下、右上腹放置2个Trocar，以引入手术器械。根据结石大小在胆囊体部做一切口，吸引器吸出胆汁，胆囊腔内置入可弯曲式胆道镜，用5.0 %葡萄糖水冲洗胆囊腔，清洗附着在胆囊壁上的胆汁及黏液、充盈胆囊腔。胆囊结石通过取石网篮取出或用抽吸法取出。(3)pCLE检查：结石取净后，静脉注射荧光素钠(10.0 %,2 mL,Alcon Laboratories,Inc.)30 s后，从胆道镜孔道中置入pCLE(Cholangioflex, Mauna Kea Technologies,法国)探查胆囊黏膜，可弯曲式胆道镜辅助pCLE移动。(4)进一步治疗：根据pCLE检查结果，正常胆囊用活检钳(Radial JawTM 4,波士顿科学，美国)在经典部位取材送活检，胆囊良性息肉用热活检钳行电切除，肿瘤性病变或癌前病变行胆囊切除术，所有标本送病理科行组织学检查。用3-0可吸收线缝合胆囊体部切口，观察无活动出血、无胆汁漏出后关腹。(5)术后处理：术后观察24 h，患者无出血、穿孔等并发症，术后24 h进食，术后72 h出院。术后3个月随访肝功能、腹部超声等检查。

2 结果

2.1pCLE诊断与病理结果 纳入的28例患者中，共获得29段pCLE检查录像，根据pCLE图像获得29个pCLE诊断；送检标本29例，获得29个术后病理诊断结果。其中，19例患者术中pCLE胆囊扫查诊断为正常胆囊黏膜，术后病理结果与pCLE一致；1例术中发现小网膜隆起，术中pCLE检查考虑恶性肿瘤，行胆囊切除+小网膜隆起切除术，术后胆囊病理未见异常，小网膜隆起病理结果考虑血管源性肿瘤；8例术中发现胆囊息肉样病变，术中pCLE考虑胆固醇性息肉5例(行息肉电切术)，腺瘤性息肉2例、恶性肿瘤1例(3例行胆囊切除术)；术后病理显示胆固醇性息肉5例，腺上皮低级别瘤变2例，中分化腺癌1例。本次研究中，术中pCLE与术后病理结果对照，准确率达100 %。见表1。

2.2不同胆囊状态下pCLE特点

2.2.1正常胆囊黏膜 pCLE下为高亮的背景和直径为5～10 μm的黑色细胞，细胞间可见直径约10 μm的微血管，局部可见约50 μm×120 μm的腺体样结构，中央黑色，边缘为高亮的刷状缘，排列整齐。

表1 患者术前、术中、术后诊断情况表

其中，胆囊底黏膜背景透亮，细胞排列稀疏，可见袢状微血管；胆囊体可见大量灰色背景细胞，直径5～10 μm线性微血管；胆囊颈可见较多椭圆形腺体，边缘可见大量柱状腺细胞之间少量铅笔样细胞，呈刷状缘排列。部分病例可见少量约25 μm×40 μm的类似腺体结构，结合术后病理，考虑为阿-罗氏窦。

2.2.2胆固醇性息肉 pCLE下呈紧密排列的黑色圆形细胞，细胞边缘清晰，排列整齐，密度尚均匀，直径约20 μm，周围黏膜缺乏血供，息肉基底部为正常胆囊背景细胞。

2.2.3腺瘤性息肉 pCLE下可见明显增大的腺体，边缘为整齐、拉长的腺细胞，细胞界限清晰，腺体排列较正常腺体紧密。与正常腺体不同的是，腺瘤性息肉腺体由许多黑白相间的腺细胞组成，直径约40 μm。腺体之间可见直径约20 μm的线性微血管。

2.2.4血管源性肿瘤 pCLE下呈大量大小不一、排列紊乱的黑色细胞，细胞直径20～40 μm，间隙中可见大量5～10 μm的微血管袢。因为此病变是在小网膜发现的，病变周围可见大量透亮背景下排列整齐、大小不等的四边形黑色脂肪细胞。

2.2.5腺癌 pCLE下呈团块状，细胞极向紊乱，大小不等，形状不规则，细胞边界模糊，腺体极度不规则，局部腺体消失，腺体之间可见直径>40 μm、走行扭曲的微血管。

2.3各形态指标在pCLE诊断不同胆囊疾病中的意义 与正常胆囊黏膜相比，本研究预先建立的MVD、MVR、CD、CM、CS、GM等6个指标中，胆固醇性息肉在CD上有区别，腺瘤性息肉在MVD、CD、GM方面有区别，腺癌在MVD、MVR、CD、CM、GM上差异均有统计学意义(P<0.05)，而CS在胆囊正常黏膜与各种疾病之间差异无统计学意义(P>0.05)。见表2、表3。

表2 不同胆囊疾病黏膜pCLE形态特点

表3 不同胆囊疾病黏膜pCLE下MVD、CD、CS值与正常胆囊黏膜差异性比较[P,95 %CI]

3 讨论

大量研究表明，共聚焦激光显微内镜(confocal laser endomicroscopy，CLE)在消化系统疾病诊断和应用方面具有独特的优势，可获得与病理准确性相当的诊断结果[11]，尤其在早期疾病诊断、判断病变良恶性、或症状较轻时微小结构的改变有着不可替代的优势[12-13]。CLE可大大提高靶向活检的效率，更大程度保持病变完整，有利于后续治疗[14]。在胆胰疾病诊断方面，CLE因其“活体病理”的优势可在无创伤的前提下获得更多病理信息，配合现有的内镜诊断技术，诊断准确率及操作时间均优于细胞学检查。一项荟萃分析[15]指出，CLE诊断胰腺浆液性囊腺瘤的准确率高达88.6 %，敏感性和特异性分别为82.4 %和96.6 %，对比单纯超声内镜下细针穿刺，CLE更准确(OR=3.94,95 %CI=1.58-9.82;P=0.003)，且平均操作时间仅6.094 min，可快速、高效、准确地诊断胰腺囊性疾病。

在CGPS中，对于胆囊潜在恶变风险或“意外胆囊癌”等情况[16]无法作出可靠的判断和及时的应对。pCLE通过可弯曲式胆道镜的辅助迅速对全胆囊黏膜进行扫查，实现术中“活体病理”诊断。本研究中共有28例拟行CGPS患者，通过术中pCLE检查，有14.3 %(4/28)的患者术中改变手术方案，行腹腔镜下胆囊切除术。术后病理结果也证实了pCLE的准确性(100 %，28/28)。所有pCLE检查均在15 min内完成，体现出pCLE的高效性。pCLE具备实时、无创、准确、快速、高效等特点，是对CGPS术中诊断很好的补充。

结石复发是目前CGPS术后主要并发症之一[17]。CGPS术前诊断依赖超声、CT、MRI等影像学结果，有漏诊癌前病变甚至癌的可能，越微小、越早期的病变越容易被漏诊。有研究认为CGPS术后胆囊是胆囊癌的危险因素之一[8]。本研究中，pCLE在胆囊颈部发现阿-罗氏窦结构。阿罗氏窦的增多是慢性胆囊炎症的重要表现之一。胆囊慢性炎症的程度与周期是胆囊癌、胆囊结石形成的因素之一[8,17]。通过pCLE对阿-罗氏窦的观察与分析，或许能为CGPS术后胆囊结石复发、胆囊癌发生等的相关因素提供新的依据。

本研究初步对胆囊正常黏膜、胆固醇性息肉、腺瘤性息肉及腺癌的pCLE表现作出了特征性描述，通过对比各微观指标差异性，发现微血管直径、微血管走行、细胞直径、细胞形态、腺体形态等5个指标可能会成为pCLE诊断胆囊疾病标准的指标。由于本研究总体样本量不大，其中胆囊腺瘤性息肉、腺癌样本量较小，需要以后大样本量研究的进一步支持与验证。

综上所述，本研究利用pCLE作为CGPS术中诊断，说明其具有实时、无创、准确、快速、高效的特点，在临床应用中具有很大的潜力和广阔的前景。