参透基因定位方法和流程

北京

基因定位就是确定基因在细胞中的位置，本文将按照三个步骤进行基因定位：第一步，将基因定位在细胞质或细胞核（X 染色体、Y 染色体、常染色体）；第二步，将基因定位在具体染色体；第三步，将基因定位在染色体的具体位置。笔者利用已知的形态学标记、细胞学标记、DNA 分子标记等技术，采用经典遗传学、细胞遗传学、分子遗传学的相关方法，结合具体题目，对基因定位进行深度解析。

1.定位在细胞质或细胞核（X 染色体、Y 染色体、常染色体）

一般可采用家系调查、发病率调查（关注♀、♂差异）、正反交实验等经典遗传学方法进行基因定位，需注意人类不可设计正反交实验，但可寻找正反交案例，如表1。

表1

2.定位在具体染色体

一般可利用已知的形态学标记、细胞学标记、DNA分子标记等技术进行基因定位，观察待测基因与已知标记是否存在连锁关系，从而将其定位于具体染色体。

2.1 形态学标记

形态学标记即已知基因对应的性状，一般肉眼可见。待测基因与已知基因遗传时若遵循基因自由组合定律，则待测基因与已知基因位于非同源染色体上；若遵循连锁互换定律，则待测基因与已知基因位于一对同源染色体上。此方法的特点：数量少、周期长、多态性少、受环境影响等。

【例1】P1 为新发现的黄瓜果实苦味纯合品系，将其与P3（隐性纯合）杂交得F1，F1测交结果如表2，已知控制果皮光泽、果皮绿色深浅、刺瘤密稀性状的基因，分别位于黄瓜的4、6、7 号染色体上，推测控制P1 果实苦味的基因位于____号染色体上。

表2

【参考答案】7

【解析】①②测交结果遵循基因自由组合定律，所以苦味基因不位于4、6 号染色体上；③测交结果符合连锁互换定律，所以苦味基因位于7 号染色体上。

2.2 细胞学标记

细胞学标记一般要用显微镜观察。借助已知的染色体变异，包括染色体数目变异的单体、三体、细胞融合技术；染色体结构变异的缺失、易位等。若待测基因与其存在连锁关系，即可确定基因位于该号染色体上。此方法的特点：几乎不受环境影响、数量少、材料获取困难、费时、费力、有些标记对生物有害等。

2.2.1 利用染色体数目变异——单体

已知某隐性突变基因（a）位于常染色体上，现有某号染色体单体的显性个体，利用其探究a 基因是否在该号染色体上。过程如图1 所示：

图1

若F1显性性状∶隐性性状=1 ∶1，可推知该基因位于单体所在的该号染色体上；若F1全部是显性性状，可推知该基因不在该号染色体上。

2.2.2 利用染色体数目变异——三体

已知某隐性突变基因（a）位于常染色体上，现有某号染色体三体的显性个体，利用其探究a 基因是否在该号染色体上。过程如图2 所示：

图2

若F2显性性状∶隐性性状=5 ∶1，可推知该基因位于三体所在的该号染色体上；

若F2显性性状∶隐性性状=1 ∶1，可推知该基因不在该号染色体上。

2.2.3 利用染色体数目变异——细胞融合技术

已知人鼠细胞融合过程中，鼠细胞会完整保留，人细胞染色体会随机丢失，利用含有不同数量和类型人染色体的杂种细胞，表达出不同的人类基因产物，如表3 所示（+代表有，-代表无）。

表3

推知：a 基因位于1 号染色体，b 基因位于2 号染色体，c 基因位于1 号染色体，d 基因位于2 号染色体。

2.2.4 利用染色体结构变异——缺失

诱变处理显性纯合子的花粉使其发生染色体片段缺失，然后为隐性纯合子母本授粉。

图3

对F1表现为隐性性状的个体进行细胞学鉴定，观察其发生缺失染色体为几号染色体，即可推测控制该性状的基因位于该号染色体缺失区段。

2.2.5 利用染色体结构变异——易位

A 品系相互易位涉及基因连锁群Ⅱ和Ⅸ，B 品系相互易位涉及基因连锁群Ⅱ和Ⅻ，前者涉及染色体 7 和染色体9，后者涉及染色体9 和染色体11。

可知:基因连锁群Ⅱ属于染色体9，基因连锁群Ⅸ属于染色体7，基因连锁群Ⅻ属于染色体11。

2.3 DNA 分子标记

DNA 分子标记即已知的可遗传并可检测的DNA 序列。可用PCR 技术、DNA 分子杂交技术或DNA 测序技术等来检测。此方法的特点：直接以DNA 形式呈现，不受环境影响；数量多；多态性高；多呈共显性；可鉴定基因型；遵循遗传规律；需要技术支持。此方法主要用于基因定位、遗传图谱制作、亲缘关系鉴定、基因型分析等方面。

2.3.1 基于PCR 技术的DNA 分子标记

短串联重复序列（SSR），如图4 所示，其内侧为1-6bp核苷酸串联重复序列；两侧序列高度保守（设计引物），特点为可PCR 扩增；种类多、分布广；有多态性、共显性。

图4

【例2】图4 发现某人类罕见遗传病，对其进行深入研究，请回答下列问题：

（1）通过对患者进行_____调查得到图5 所示图谱，据图5 可初步断定该病为_____性遗传病，致病基因位于_____染色体上。

图5

（2）为确定该病在几号染色体上，提取家系成员的血细胞DNA，利用多组“微卫星DNA”分子标记进行鉴定，其中利用________技术扩增5 号染色体上的M 分子标记结果如图5（与系谱图成员上下对应），根据图6 中信息选择一组合适的引物：______ 。

图6

（3）根据图5 分析，除Ⅲ8 外所有患者均有_____（填“M1”“M2”“M3”或“M4”）类型的分子标记，说明致病基因与其高度连锁，所以该致病基因位于______号染色体上。

（4）据图5 分析Ⅱ3、Ⅱ4 基因型（用A、a 表示）和相应分子标记并标在图7 相应位置。

图7

（5）据图5 推断Ⅲ8基因型为______，若电泳图显示其有M3M4 分子标记，分析其产生的可能原因________。

【参考答案】（1）家系 显 常 （2）PCR b、c （3）M2 5 （4）Aa aa

图8

（5）Aa Ⅱ3减数分裂形成配子时同源染色体非姐妹染色单体发生交叉互换产生AM3 雌配子，与Ⅱ4的aM4雄配子结合，形成受精卵发育成Ⅲ8个体

【解析】（1）因为该病为罕见遗传病所以针对患者进行家系调查；由于Ⅱ1、Ⅱ4不携带致病基因且连代遗传，所以该病为显性遗传病；Ⅱ2为男性患者而Ⅲ1为女性正常人，所以不可能为伴X 染色体显性遗传，推知致病基因位于常染色体。（2）DNA 扩增需用PCR 技术进行,引物结合在两侧保守序列的3'端。（3）据图5 分析，所有患者都有M2 标记，可知致病基因与其高度连锁位于5 号染色体。（4）电泳点样孔在上方，所以越接近点样孔分子标记越大，即重复次数越多，反之越小，所以分子标记如图7，Ⅱ3、Ⅱ4的基因型分别是Aa、aa，M2 与A 连锁，所以确定基因相应位置（如图8）。（5）Ⅲ8基因型为Aa，分子标记却是M3M4，说明Ⅱ3的A 没有与M2 一起进入配子，所以原因是Ⅱ3减数分裂形成配子时同源染色体非姐妹染色单体发生交叉互换产生AM3 雌配子，与Ⅱ4的aM4 雄配子结合，形成受精卵发育成Ⅲ8个体。

2.3.2 基于DNA 分子杂交技术的DNA 分子标记

限制酶切片段长度多态（RFLP），如图9 所示，RE限制酶可将DNA 切出不同长度的片段，DNA 碱基改变导致其酶切位点改变，限制酶切片段结合特定探针可作为分子标记。待测基因与该分子标记紧密连锁，进行基因定位。

图9

【例3】成人型多囊肾病具有明显的家族性，一般在35 岁以后逐渐发病，α-珠蛋白-3'HVR 探针是该病早期诊断的常用方法。研究人员利用α-珠蛋白-3'HVR 探针及电泳等相关技术对某患者家族的1～7 号成员进行DNA检测，结果如图11 所示。请回答问题：

图10 成人型多囊肾病遗传系谱

图11 α-珠蛋白-3'HVR 探针检测的电泳结果

（1）研究发现该家族的成人型多囊肾病由显性基因控制，据图10 分析，该病的致病基因位于______（填“常”“X”或“Y”）染色体。

（2）人的16 号染色体上α-珠蛋白基因的3′端容易发生突变，α-珠蛋白-3′HVR 探针能够根据___________原则检测该区突变片段的差异，综合图10、图11 结果分析，患者都具有的α-珠蛋白基因片段是_________kbp。

（3）被检测的α-珠蛋白基因与成人型多囊肾病基因高度连锁，可以推断该致病基因位于___号染色体上，且在染色体的位置上距离__________基因比较接近。

【参考答案】（1）常 （2）碱基互补配对 7.0（3）16 α-珠蛋白

【解析】（1）已知该病为显性，由1 号为正常人而4 号为患者可推知该病的致病基因不位于X 染色体，而是位于常染色体。（2）探针检测根据碱基互补配对原则，电泳图中所有患者均有7.0 kbp。（3）α-珠蛋白基因与成人型多囊肾病基因高度连锁，所以致病基因位于16号染色体，因高度连锁所以距离α-珠蛋白基因比较接近。

2.3.3 基于测序技术的DNA 分子标记

单核苷酸多态性（SNP）主要是用以寡核苷酸杂交为基础的DNA 芯片技术，直接以序列变异作为标记（如图12），是目前使用最广泛的标记。

图12

【例4】SNP 是基因组水平上由单个核苷酸的变异引起的DNA 序列多态性。科研人员利用SNP 对拟南芥抗盐突变体的抗盐基因进行定位。

（1）SNP 在拟南芥基因组中广泛存在，在不同DNA分子及同一DNA 分子的不同部位存在大量SNP 位点，某些SNP 在个体间差异稳定，可作为DNA 上特定位置的遗传______。

（2）研究者用化学诱变剂处理野生型拟南芥，处理后的拟南芥自交得到的子代中抗盐∶不抗盐=1 ∶3，据此判断抗盐为_______性状。

（3）为进一步得到除抗盐突变外，其他基因均与野生型相同的抗盐突变体（记为m），可采用下面的杂交育种方案。

步骤一：抗盐突变体与野生型杂交；

步骤二：_____________________；

步骤三：_____________________；

步骤四：多次重复步骤一～步骤三。

（4）为确定抗盐基因在Ⅱ号还是Ⅲ号染色体上，研究者用抗盐突变体m 与另一野生型植株B 杂交，用分别位于两对染色体上的SNP1 和SNP2（如图13）进行基因定位。

图13

①将m 和B 进行杂交，得到的F1植株自交。将F1植株所结种子播种于________的选择培养基上培养，得到F2抗盐植株。

②分别检测F2抗盐植株个体的SNP1 和SNP2，若全部个体的SNP1 检测结果为________，SNP2 检测结果SNP2m 和SNP2B 的比例约为________，则抗盐基因在Ⅱ号染色体上，且与SNP1m 不发生交叉互换。

【参考答案】（1）标记 （2）隐性 （3）得到的F1自交 筛选抗盐突变体 （4）①含（一定浓度）盐 ②均为SNP1m1 ∶1

【解析】（1）据题意SNP 可作为遗传标记。（2）据性状分离比可判断抗盐为隐性性状。（3）据题意，杂交育种的目的为得到除抗盐基因突变外，其他基因均与野生型相同的抗盐突变体。（4）据题抗盐基因位于Ⅱ号染色体，突变体具有抗盐隐性性状，所以F2所有抗盐个体抗盐基因均与SNP1m标记连锁，与Ⅲ号染色体的SNP2 存在自由组合关系，所以SNP2m和SNP2B的比例约为1 ∶1。

3.定位在染色体具体位置

3.1 计算重组率

同源染色体的非姐妹染色单体发生交叉互换，导致同源染色体上的非等位基因重组，非等位基因距离越近，它们之间发生交换概率越小，形成重组型配子概率越小，反之则越大，DNA 分子标记也遵循该规律。利用两点或三点测验法计算重组型配子所占比例即可推出基因之间及基因与分子标记之间的相对距离，进而绘制出遗传图谱，单位cM。

【例5】已知控制玉米籽粒有色（C）/无色（c）、饱满（S）/凹陷（s）、非糯（W）/糯性（w）的三对基因均位于9 号染色体上，请根据下列三个实验，确定无色凹陷糯性个体9 号染色体上三个基因的位置关系。

表4

图14

【参考答案】

图15

【解析】Cc-Ss 重组率：4%；Ww-Ss 重组率：20%；Ww-Cc 重组率：24%；所以无色（c）、凹陷（s）、糯性（w）基因的相对距离如图15。

【例6】已知某致病基因A 位于5 号染色体上，其上还有两种“微卫星DNA”分子标记M、N，统计基因和分子标记类型为AaM1M2N1N2 个体产生配子种类和比例为AM2N2 ∶aM1N1 ∶AM2N1 ∶aM1N2 ∶AM1N2 ∶aM2N1=10 ∶10 ∶3 ∶3 ∶2 ∶2，若只考虑交换一次，请在图16中标出AaM1M2N1N2个体的基因和分子标记位置。

图16

【参考答案】

图17

【解析】根据配子种类和比例可知AM2N2 连锁，aM1N1 连锁，均位于5 号染色体上。Aa-M1M2 重组率：4/30；Aa-N1N2 重组率：6/30；M1M2-N1N2 重组率：10/30，所以位置关系如图17。

3.2 利用已知序列转座子或T-DNA

利用已知序列的转座子或T-DNA 的随机插入，导致基因突变，推知基因功能，根据已知序列设计引物或探针，可测得基因位置、获取基因序列。

【例7】根据T-DNA 的已知序列，利用PCR 技术可以扩增出被插入的基因片段。其过程是提取_________植株的DNA，用限制酶处理后，再用___________将获得的DNA片段连接成环（如图18），以此为模板，从图中A、B、C、D四种单链DNA片段中选取______作为引物进行扩增，得到的片段将用于获取该基因的全序列信息。

图18

【参考答案】突变体 DNA 连接酶 B、C

【解析】只有突变体植株的DNA 被已知T-DNA 插入，所以提取突变体的DNA，用限制酶切割后用DNA 连接酶连接成环，利用T-DNA 的已知序列设计引物扩增被插入基因的序列，A、C 为顺时针方向，B、D 为逆时针方向，扩增被插入基因需B、C 这组引物。

3.3 原位杂交法

原位杂交法为根据目的基因序列设计探针，直接与变性的染色体DNA 按碱基互补配对原则杂交，通过检测记录杂交信号进行基因定位，流程如图19。

图19

总之，基因定位的方法很多，本文主要是利用已知的标记技术结合经典遗传学、细胞遗传学、分子遗传学的方法进行基因定位，最终绘制出遗传图谱和物理图谱。