小麦抗赤霉病种质筛选与Fhb1基因分布研究

张善磊，于成功，刘晓飞，赖尚科，王卫军，孙宝林，熊化春，胡继超，崔小平

(宿迁市农业科学研究院，江苏 宿迁 223800)

小麦赤霉病是由禾谷镰刀菌(FusariumgraminearumSchw)等多种镰刀菌引起的一种真菌性病害，我国赤霉病年均发病面积超出330万hm2，一般流行年份即可造成产量损失5%～10%，重发田块甚至绝收，给我国粮食安全造成了严重的威胁[1-3]。目前，生产上防治赤霉病主要依赖喷施化学药剂，这不仅会增加生产成本，还会对农产品和环境安全带来隐患，并且赤霉病菌生理小种不断演化，抗药性逐渐增强[4]。实践证明，利用品种抗性防治赤霉病是最为安全、经济、有效的手段。随着分子标记技术的发展和小麦基因组学研究的深入，迄今至少有100个抗赤霉病基因被报道，分布于小麦的所有染色体上，其中被正式命名的抗性基因有7个(Fhb1～Fhb7)[5-7]。Li等[8]研究发现Fhb1编码一个注释为富含组氨酸的钙离子结合蛋白(Histidine-rich calcium-binding protrin,His)，与野生型相比，该基因起始密码子附近752 bp的缺失赋予其赤霉病抗性。Wang等[9]研究发现，来自长穗偃麦草的赤霉病抗性基因Fhb7编码一种谷胱甘肽S-转移酶(Glutathione S-transferase,GST)，能够分解多种毒素，具有广谱抗性。此外，源于小麦自身的抗性基因Fhb2被精细定位在6B染色体上，与标记Xwgrb688/Xwgrb682和Xmag3017紧密连锁[10]；Fhb4被精细定位在4B染色体上，与标记Xmag8990和Xmag8894紧密连锁[10]；Fhb5被精细定位在5A染色体上，与标记Xwgrb0222和Xwgrb1621紧密连锁[10]。

Fhb1是最早发现于我国小麦品种苏麦3号中的一个持久、稳定抗性基因，是目前公认的赤霉病抗性效应最大的位点。Pumphrey等[11]以苏麦3号为供体亲本，创制了携带Fhb1基因的近等基因系，发现该近等基因系的平均病粒率降低了27%，平均病情严重等级降低了23%。张宏军等[12]以周麦16为轮回亲本构建6个回交群体，研究发现含有Fhb1家系的平均病小穗数和病情指数较不含Fhb1家系分别低4.2和4.0。李静静等[13]采用系谱法和分子标记辅助选择相结合的方法培育出13份仅含有Fhb1基因的优异小麦新品系，接种鉴定结果表明其赤霉病抗性可达到中抗水平。由于Fhb1基因具有广谱、持久抗性，因而在小麦特别是长江中下游麦区的春性品种抗赤霉病改良上得到广泛的应用。然而，作为我国重要商品粮基地的黄淮冬麦区，因历史上该区赤霉病不是小麦生产中的主要病害，使得抗赤霉病育种未能得到足够重视，育成的很多品种对赤霉病抗性较弱或无抗性。因此，鉴定、挖掘优异抗性资源材料，明确Fhb1基因在小麦栽培品种中的分布及其与赤霉病的抗性关系，对小麦赤霉病抗性育种中亲本材料的选择具有重要意义。

本研究采用单花滴注法，对省内外154份小麦品种(系)进行赤霉病田间抗性接种鉴定，并利用赤霉病抗性基因Fhb1的诊断性标记进行基因型检测，分析该抗性基因在供试材料中的区域分布和利用状况，评价其对赤霉病的抗性效果。本研究旨在筛选抗赤霉病种质资源，分析赤霉病抗性基因Fhb1在小麦栽培品种抗赤霉病改良中的利用价值，为育种利用提供可靠的亲本材料。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试材料为154份小麦品种(系)，其中安徽省12份、河北省9份、河南省44份、江苏省52份、山东省23份、陕西省14份。以苏麦3号(抗赤霉病)、宁麦13(中抗赤霉病)、淮麦20(中感赤霉病)和矮抗58(感赤霉病)为赤霉病接种鉴定的对照材料。供试材料均种植于宿迁市农业科学研究院泗阳试验基地，每个品种(系)种植4行，行长1.5 m，行距20 cm，常规栽培方式管理。

1.2 赤霉病菌的接种与抗性统计

赤霉病菌供试菌株由江苏省农业科学院植物保护研究所提供，包括4个强致病力的生理小种，为F0301、F0609、F0980和F1312。赤霉病抗性鉴定方法参照《NY/T 1443.4—2007 小麦抗赤霉病评价技术规范》。在小麦抽穗扬花初期，用移液器将4个小种菌株的混合菌液注入麦穗中部的1个小花中，每品种接种20个麦穗，病情稳定后按赤霉病调查标准进行调查记载。严重度分级标准为：0级，接种小穗无可见发病症状；1级，仅接种小穗发病或相邻的个别小穗发病，但病斑不扩展到穗轴；2级，穗轴发病，发病小穗占总小穗数的1/4以下；3级，穗轴发病，发病小穗占总小穗的1/4～1/2；4级，穗轴发病，发病小穗占总小穗的1/2以上。

抗性评价标准：免疫(I)，平均严重度=0；抗病(R)，0<平均严重度<2.0；中抗(MR)，2.0≤平均严重度<3.0；中感(MS)，2.0≤平均严重度<3.5；感病(S)，平均严重度≥3.5。

平均严重度=∑(各级病穗数×各级代表值)/总调查穗数

病情指数=∑(各级病穗数×各级代表值)/(总调查穗数×最高级代表值)

1.3 DNA提取和Fhb1基因鉴定

分蘖盛期采集各小麦品种(系)的幼嫩叶片，采用Zhang等[14]的CTAB法提取基因组DNA，采用朱展望等[15]设计的His-InDel标记His3B-4对供试材料进行Fhb1基因检测，引物序列为His3B-4F：5′-ATGCGTGCGCTGTACTTG-3′，His3B-4R：5′-CGTCACAGAGTCCAGTGAAA-3′，由南京擎科生物科技有限公司合成。

20 μL的PCR反应总体系包含：10×Buffer(25.0 mmol/L)2 μL，dNTP(2.5 mmol/L)0.4 μL，正反向引物(10 μmol/L)0.5 μL，Taq酶(2 U/μL)0.4 μL，模板DNA(20 ng/μL)2 μL，用灭菌ddH2O补足20 μL。PCR扩增反应条件：95 ℃预变性4 min；95 ℃变性30 s，65 ℃复性30 s，72 ℃延伸2 min 30 s，35个循环；72 ℃延伸10 min。反应产物在2%琼脂糖凝胶上电泳分离，DuRed核酸燃料染色后，在紫外凝胶成像仪上观察记载。

2 结果与分析

2.1 Fhb1抗性基因在小麦品种(系)中的分布情况

利用赤霉病抗性基因Fhb1的诊断性标记对154份小麦品种(系)进行基因型检测。其中His3B-4标记在含有Fhb1抗病等位基因的品种苏麦3号、宁麦9号、徐麦17252等中扩增出1309 bp的预期条带，而在矮抗58、新麦26、泗麦1702等中扩增出2061 bp左右的条带(图1、表1)。从抗病基因分布来看，154份供试小麦品种(系)中鉴定到含Fhb1基因的材料有7份，主要分布在江苏育成的品种(系)中，而在安徽、河北、河南、山东、陕西小麦品种(系)中分布较少。在此基础上，按小麦类型对江苏育成的52份小麦品种(系)进行划分，发现Fhb1基因在江苏淮南小麦品种中的分布远高于淮北小麦。

表1 Fhb1基因在小麦品种(系)中的分布情况

续表1：

2.2 不同地区来源小麦品种(系)的赤霉病抗性分析

根据赤霉病接种鉴定结果，抗病对照苏麦3号的平均严重度为1.6，中抗对照宁麦13的平均严重度为2.7，中感对照淮麦20的平均严重度为3.2，感病对照矮抗58的平均严重度为4.0，这表明接种鉴定结果较为可靠。在154份小麦品种(系)中，表现中抗及以上的品种(系)有16份，所占比例为10.39%；表现中感的品种(系)有27份，所占比例为17.53%；表现感病的品种(系)有111份，所占比例为72.08%(表2)。

根据上述结果对小麦品种(系)进行6个区域划分，分别统计不同地区来源供试材料的赤霉病抗性水平。在安徽地区12份小麦品种(系)中，表现感病的材料有11份，所占比例为91.67%。与安徽地区类似，河北地区小麦品种的抗性较差，大多表现感病。在44份河南小麦品种(系)中，中抗1份、中感6份、感病37份，所占比例分别为2.27%、13.64%和84.09%。在山东和陕西地区材料中，表现中抗的品种(系)各有1份，所占比例分别为4.35%和7.14%；中感品种(系)分别有3份和4份，所占比例分别为13.04%和28.57%；感病品种(系)分别有19份和9份，所占比例分别为82.61%和64.29%。在江苏地区52份品种(系)中，表现中感以上的品种(系)有25份，其中抗病品种1份、中抗品种(系)12份、中感品种(系)12份、感病的品种(系)有27份，所占比例为51.92%，远低于其他地区，这可能与江苏小麦品种审定中侧重于赤霉病抗性有关(表2)。

表2 供试小麦品种(系)中的赤霉病鉴定结果

2.3 江苏省小麦品种(系)的赤霉病抗性差异比较

由表3可知，43份淮北小麦品种(系)的病小穗率和病情指数分别为19.63%～100.00%和0.55～1.00，其中淮麦920、泗5334、康F和徐麦17252等8个品种(系)表现中抗，所占比例为18.60%；淮麦43、泗1516和瑞华麦521等11个品种(系)表现中感，所占比例为25.58%；表现感病的品种(系)有24份，所占比例为55.81%，没有鉴定到达抗病水平的品种(系)。9份淮南小麦品种(系)的病小穗率和病情指数分别为7.66%～78.73%和0.40～1.00，其中抗病品种有1份，中抗品种有4份，所占比例为44.44%；中感品种有1份，所占比例为11.11%；感病品种有3份，所占比例为33.33%，由此可见，淮南小麦品种(系)的赤霉病抗性明显好于淮北小麦。

表3 不同生态类型小麦品种(系)的赤霉病抗性反应

续表3：

3 结论与讨论

赤霉病是制约我国小麦生产的重要病害，在小麦抽穗扬花期，病菌侵染穗部并迅速扩展，阻碍养分输送，造成大量枯死穗，从而严重影响小麦产量，同时感病麦粒携带多种毒素，危害人畜健康[16-17]。近年来，该病已由长江中下游等麦区迅速向黄淮麦区扩展，现已成为黄淮麦区的常发病害，对我国小麦生产造成了极大影响。2001～2018年赤霉病多年在江苏地区偏重发生，其中2012年淮安、盐城、南通、泰州等地广泛发生，自然发生程度为近几年来最重，产量损失50%以上的重发面积达13.33万hm2，严重田块甚至颗粒无收[18]。据统计该年江苏、河南和安徽3个省份的赤霉病发病面积合计为44.26万hm2，占全国发病面积的66%以上，造成实际损失达207.97万t[19-20]。品种抗性较弱或无抗性，一直是黄淮及北部冬麦区育种难以攻克的难题。王震等[21]研究发现，河南省大面积种植的小麦品种大多高感赤霉病。董连生[22]研究发现安徽省小麦品种对赤霉病抗性表现较差。常蕾等[23]研究发现江苏淮北小麦品种多为感病。由此可见，加强小麦抗赤霉病种质发掘与创新，深入挖掘优异抗病基因资源，对提高江苏乃至全国小麦赤霉病抗性至关重要。

本研究采用单花滴注法对省内外154份小麦品种(系)的赤霉病抗性进行接种鉴定，结果有111份表现感病，占供试总材料的72.08%，而中抗及以上品种(系)仅有16份，可见现有多数小麦品种的赤霉病抗性普遍较差。本研究中不同地区来源的小麦材料的赤霉病抗性存在明显差异，江苏地区小麦品种(系)的赤霉病抗性较好，52份供试材料中，中感及以上品种(系)有25份，占该地区来源供试材料的48.08%，其中中抗及以上品种(系)有13份；陕西省次之，中感及以上品种(系)占该地区来源供试材料的35.71%；安徽、河北、河南和山东地区品种(系)的赤霉病抗性较差，感病品种所占比例均在80%以上。前人研究发现江苏淮南小麦的赤霉病抗性优于淮北小麦品种(系)，这与本研究结果具有一致性，43份淮北小麦材料中感病品种(系)所占比例为55.81%，明显高于淮南小麦(33.33%)，究其原因，可能与我国目前抗赤霉病育种中多以苏麦3号和宁麦9号为抗源材料有关，抗源本身生态类型不同，与偏冬性小麦杂交后代分离大，以致于很难在短期内选育出适合淮北种植的兼具抗病、优质和丰产于一体的优良品种。Fhb1基因是目前已知的小麦中最重要的赤霉病抗性基因，抗性最强且稳定，同时还能降低病粒中毒素的积累。Rawat等[24]最先报道了Fhb1基因的克隆结果，发现该基因编码一种穿孔毒素凝集素(pore-forming toxin-like，PFT)，基因沉默及过表达和突变体分析实验证实PFT是小麦3BS上的Fhb1赤霉病抗性基因。然而，这一研究结果未能完全被国内其他课题组验证，且基于该基因开发的特异性分子标记也不能将抗、感赤霉病品种完全区分。2019年，Li等[8]克隆到PFT侧翼的(Histidine-rich calcium-binding protein，His)His基因，通过分子标记辅助选择，将该基因导入山东、河南、江苏等省的中感或高感品种中，可显著提高品种的抗赤霉病扩展能力。朱展望等[15]针对His基因抗感等位基因序列差异开发出能将苏麦3号等明确携带Fhb1基因的品种与西农9871等感病品种区分开的诊断性标记，为小麦抗赤霉病育种提供了简便、高效的技术支撑。本研究利用赤霉病抗性基因Fhb1的诊断性分子标记，对154份小麦品种(系)的基因型进行检测，明确了该基因在小麦栽培品种中的分布，为小麦赤霉病抗性改良提供优异亲本。154份小麦品种(系)中检测到7份携带Fhb1抗性基因，其赤霉病抗性鉴定均在中抗及以上水平，表明该基因具有较高的育种利用价值。从基因的分布来看Fhb1基因在江苏淮南小麦品种中的分布较广，而在其他地域来源的品种(系)中极少存在，说明可以进一步扩大该基因的使用，可将携带Fhb1基因的品种通过杂交和分子标记辅助选择的方式，将目的基因定向导入感病品种中，培育出如徐麦17252、康F等适合黄淮及北部冬麦区种植对赤霉病抗性较好的品种(系)，从而规避赤霉病给我国小麦生产带来的巨大威胁，对产业提质增效、保障国家粮食安全具有重大意义。