巨噬细胞对小鼠诱导多能干细胞向肝祖细胞分化的影响

宫甜甜，黄少刚，孙瑞珍，申景岭，李秋明，雷 蕾，单智焱

1 哈尔滨医科大学 组织学与胚胎学教研室， 哈尔滨150081；2 哈尔滨医科大学大庆校区 组织学与胚胎学教研室， 黑龙江 大庆163319

肝祖细胞(hepatic-like progenitor cells,HPCs)在肝再生中发挥重要作用。HPCs的微环境是由细胞、细胞外基质成分以及这些细胞所释放的生长因子和细胞因子组成的特殊微环境，这种特殊的微环境和不同成分间的相互作用影响HPCs的增殖和分化[1-2]。肝巨噬细胞具有吞噬异物、传递抗原、清除衰老细胞、参与免疫等作用，是构成肝组织微环境最重要的细胞之一；在肝损伤过程中，巨噬细胞可直接参与肝祖细胞的激活，促进肝损伤修复。研究[3]显示，巨噬细胞对不同类型的干细胞也具有调控作用。巨噬细胞与造血干细胞共培养，能促进红系细胞的分化。巨噬细胞还能促进骨髓间充质干细胞的成骨细胞分化[4]。本研究探讨了巨噬细胞对小鼠诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells，iPSCs)向HPCs分化的影响，为阐明HPCs发育的微环境作用奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物与细胞系 8～12周龄C57BL/6N(雌鼠)24只购自维通利华实验动物技术有限公司；实验动物生产许可证编号：SCXK(京)2016-0006，使用许可证编号：No.110011200107063283；体外诱导小鼠iPSCs细胞系(C1细胞)，为实验室冻存。

1.2 主要试剂 DMEM/F12、Neurobasal培养基、KO血清替代物(KOSR)、双抗(P/S)、非必需氨基酸(NEAA)、谷氨酰胺(L-Glu)、N2、B27、丙酮酸钠(Na-Pyr)、β-巯基乙醇(2-Mercaptoethanol)等试剂均为美国Gibco公司，DPBS、二甲基亚砜(DMSO)、胰蛋白酶明胶等均为美国SIGMA公司。

1.3 HPCs的建立过程及向肝细胞分化 将C1细胞接种在明胶上，培养液为ESM(高糖DMEM)，15% ES级别胎牛血清(ES-FBS)，100 U/L P/S，1%NEAA，2 mmol/L L-Glu，1 mmol/L Na-pyr，1000 U/L白血病抑制因子(LIF)，0.1 mmol/L β-巯基乙醇。生长3 d后，将培养液更换为添加10 ng/ml-骨形态发生蛋白4(Bmp4)和LIF的CDM培养液(DMEM/F12，Neurobasal培养基，5%ES-FBS，1%P/S，1% L-Glu，0.5× N2，0.5 ×B27)。2 d后，将C1细胞消化，以2×105个细胞/孔接种在Ⅰ型胶原包被的6孔板上，培养液更换为添加20 ng/ml 激活素A(ActivinA)和1 mmol/L丁酸钠(NaB)的CDM培养液(此时记为诱导第1天，D1)，培养2 d。D3，去除NaB，继续培养2 d。D5，将细胞消化，重新接种在明胶包被的6孔板上，用添加20 ng/ml ActivinA，20 ng/ml Bmp4和20 ng/ml 成纤维细胞生长因子(FGF)的CDM培养液培养。D7，将培养液更换为HPCs培养液，继续培养至D12。HPCs向肝细胞分化，将iPSCs-HPCs以5×105/孔接种在 Ⅰ 型胶原包被的6孔板上，无血清的CDM培养液添加10 ng/ml表皮生长因子(EGF)，10 ng/ml人类生长因子(HGF)，10 ng/ml抑瘤素 OCM，1% 二甲基亚砜(DMSO)，10-7mol/L地塞米松，培养6 d。

1.4 巨噬细胞的获取 采用腹腔冲洗法获得小鼠的巨噬细胞，在收集C57B/6N小鼠巨噬细胞的前3天，每只小鼠腹腔注射3 ml 硫胶脂注射夜。3 d后，断颈处死小鼠，腹部向上放置于泡沫板上；用剪刀和镊子切开覆膜的外侧皮肤，使其暴露内层腹膜皮肤；用5 ml注射器抽取含3%FBS的PBS 5 ml注入小鼠的腹腔内，轻轻按摩腹部，冲洗腹腔内部的巨噬细胞；再用注射器将冲洗液吸出，注意避开脾脏和肠道，避免脂肪组织或其他组织堵塞。收集到的液体应为含有巨噬细胞白色细胞悬液，立即放入冰盒上的离心管内；重复冲洗3次后，在腹膜内皮上做一个切口，用镊子揭开皮肤，用胶头吸管吸取腹腔内剩余的液体。如果收集到的细胞悬液有明显的血液污染，那么收集到的样品应该弃掉。1000 r/min离心5 min后，即可获得来源于小鼠腹腔的巨噬细胞。将巨噬细胞以1×106个/孔接种于6孔板内，更换CDM培养液培养24 h后，收上清即为Mc-CDM。将HPCs的诱导分为两组进行，一组使用正常培养基，为对照组(Ctrl组)；另一组在HPCs诱导D5使用Mc-CDM培养基，为实验组(Mc组)。

1.5 免疫荧光染色 iPSCs-HPCs接种于玻片培养48 h后，经PBS洗涤5 min/次，洗涤2次，4%PFA固定>30 min，PBS-T(PBS+0.25%Tritonx-110)洗涤5 min/次,洗涤3次;70%乙醇洗涤5 min，PBS-T洗涤5 min，封闭液(PBS-T+2%BSA)加入一抗避光室温孵育2 h；PBS-T洗涤5 min/次,洗涤3次，二抗避光室温孵育1 h；PBS-T洗涤5 min/次,洗涤3次；Hoechest 33342 染核，20 s；PBS-T 洗涤5 min；封片后荧光显微镜拍照。

1.6 PAS染色 HPCs接种于铺有盖玻片的6孔板，向肝细胞诱导分化至D6，经PBS洗涤5 min/次,洗涤2次，4%PFA固定>30 min，用PBS洗涤5 min/次,洗涤2次，高碘酸处理，去离子水洗涤10 min/次,洗涤2次，schiff染液10 min，去离子水洗涤10 min/次,洗涤 2次，Mayer苏木素复染15～30 s，去离子水洗涤10 min/次,洗涤2次，脱水，中性树脂封片。

1.7 Western Blot 将样品及Maker按顺序加入泳道，电泳、转膜，5 %脱脂奶粉封闭1 h。加入一抗，于4 ℃冰上孵育过夜。用 PBST洗去未结合的一抗，10 min/次，洗涤3次；加入二抗室温孵育1 h；用PBST洗去未结合的二抗，10 min/次，洗涤3次；避光配制ECL工作液，滴加在PVDF膜上，显影。

1.8 伦理学审查 本研究经哈尔滨医科大学大庆校区伦理委员会审批，批号：HMUDQ2020102201，符合实验室动物管理与使用准则。

2 结果

2.1 iPSCs-HPCs的建立 将小鼠iPSCs细胞系C1向HPCs诱导，诱导流程见图1a。形态学上可见，C1在明胶上呈单层细胞生长。加入NaB后, C1增殖能力降低，大量细胞出现凋亡。去除NaB后, D5细胞开始增殖，呈扁平克隆状生长。D8细胞开始铺路石状生长，且增殖旺盛；D12大部分细胞均为铺路石样，并呈圆形摊开生长(图1b)。收集诱导D12的细胞，进行免疫荧光染色，可见诱导D12细胞高表达肝祖细胞相关基因CK19和ICAM(图1c)。上述结果表明成功获得了iPSCs-HPCs。

注：a，HPCs诱导流程图；b，细胞各个诱导阶段的形态图(×10)；c，免疫荧光染色检测诱导D12细胞中CK19 及ICAM的表达(×20)。图1 iPSCs-HPCs的建立

2.2 iPSCs-HPCs可分化为有功能的肝细胞 形态学上可见，与接种后D0相比，从诱导D2开始逐渐向肝细胞的形态转变，细胞体积逐渐增大，从圆形或椭圆形逐步变为多边形。诱导D6可见细胞中央出现较大的细胞核，有的细胞出现双核结构，具有典型的肝细胞形态(图2a)。取诱导D6细胞进行免疫荧光检测，结果显示这些细胞表达肝细胞特异标志物Alb(图2b)；PAS染色可见细胞出现紫红色沉淀，说明诱导D6细胞可合成糖原，这些细胞具有肝细胞合成肝糖原的功能(图2c)。以上结果说明iPSCs-HPCs具有分化为肝细胞的潜能，且这些肝细胞具有合成糖厚的功能。

2.3 巨噬细胞促进iPSCs-HPCs形成 巨噬细胞形态及免疫荧光检测(图3a)结果显示，巨噬细胞表达其特异性基因F4/80。形态学上(图3b)，与Ctrl组相比，D8 Mc、D12 Mc组细胞形态相似，均为铺路石样扁平细胞，可见巨噬细胞对HPCs形态学无明显影响。免疫荧光染色显示，与D12 Ctrl组相比，D12 Mc组的肝祖细胞特异性蛋白CK19的表达显著增高(0.901±0.072 vs 0.686±0.097，t=-3.093，P<0.05)(图3c、d)。

2.4 巨噬细胞通过自噬提高iPSCs-HPCs功能 Western Blot结果与免疫荧光检测结果一致，与D12 Ctrl组相比，D12 Mc组肝祖细胞相关基因CK19的表达显著增高(1.922±0.103 vs 1.448±0.012，t=-7.881，P<0.05)；同时，D12 Mc组自噬相关基因LC3的表达高于D12 Ctrl组，差异有统计学意义(1.392±0.042 vs 1.101±0.048，t=-5.978，P<0.05)(图4)。以上结果说明，巨噬细胞对iPSCs-HPCs的形成起到促进作用，其作用机制可能与巨噬细胞调控iPSCs-HPCs自噬水平升高有关。

图4 两组CK19和LC3的表达水平比较

3 讨论

HPCs在鼠中亦被称为肝卵圆细胞。在正常成体肝脏中比例很小，以休眠干细胞的状态主要存在于赫氏小管(Hering管)和胆管树终末处。在成熟肝细胞的再生能力严重受损的情况下，它们开始大量增殖，从终末胆管区向肝板渗透，并向肝细胞和胆管上皮细胞分化，从而在肝再生中发挥重要作用。为了在体外成功获取稳定的，且在形态、结构和功能上与体内发育更接近的肝祖细胞，Zhou等[5]通过添加诱导因子，利用4步法，获取了小鼠胚胎干细胞来源的肝祖细胞及肝细胞；Yanagida等[6]利用三维生物构建技术成功的获得了人诱导多能性干细胞来源的HPCs。 这些生长因子、转录因子、microRNAs及小分子物质等对HPCs的形成、增殖和分化至关重要，而存在于干细胞周围的各类细胞和细胞外基质的相互作用更是控制干细胞的行为和干细胞之间平衡的关键因素。

在肝组织内，定居着大量的肝巨噬细胞。肝巨噬细胞有强大的吞噬、吞饮能力，可清除机体的病原微生物、异物及衰老细胞；能杀伤肿瘤细胞，处理、传递抗原，参与免疫应答，在维持肝组织内的微环境等方面起着重要的作用。本研究发现巨噬细胞能够促进HPCs的形成。在成体肝脏内，巨噬细胞参与维持HPCs静息状态表型，抑制其分化；在慢性炎症时，巨噬细胞分泌相关细胞因子促进HPCs的激活[7]。本研究发现在iPSCs向HPCs分化过程中，巨噬细胞可能通过调控自噬，影响HPCs的形成，提高自噬促进iPSCs向HPCs分化。这与Chen等[8]的研究一致，自噬缺乏可导致HPCs干细胞特性缺失。HPCs可能通过增加自噬水平维持其自我更新和增殖能力。此外，研究[9]表明，自噬相关基因Atg7缺陷的血干细胞表现出线粒体损伤积累、活性氧水平升高和DNA损伤。在骨髓间充质干细胞向成骨细胞的分化的早期，通过抑制mTOR的负调控激活自噬，可以促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞的分化[10]。这些研究表明，自噬在促进和维持成体干细胞的形成、自我更新和衰老中起着至关重要的作用[11]，而通过干细胞微环境中的巨噬细胞进行成体干细胞自噬的调控可能成为研究成体干细胞增殖分化的新方向。

肝脏非实质细胞，如巨噬细胞、间质、血管内皮细胞等可直接影响肝脏实质细胞的存活及肝功能。本研究初步验证了巨噬细胞对iPSCs-HPCs的形成起到促进作用，其作用机制可能与巨噬细胞调控iPSCs-HPCs自噬水平升高有关。本研究采用巨噬细胞条件培养基的方式，实现了巨噬细胞的参与，但在空间上并没有实现细胞之间的接触，在今后的工作中，拟建立巨噬细胞三维共培养模式，实现细胞间的接触，深入探讨巨噬细胞促进HPCs形成的影响机制，为干细胞的体外诱导提供新的思路。

利益冲突声明：本研究不存在研究者、伦理委员会成员、受试者监护人以及与公开研究成果有关的利益冲突。

作者贡献声明：宫甜甜、雷蕾、单智焱负责课题设计，资料分析，撰写论文；黄少刚、申景岭参与收集数据，修改论文；孙瑞珍、李秋明负责拟定写作思路，指导撰写文章并最后定稿。