基于电特性的红茶发酵中茶多酚含量快速检测方法
2021-04-19王盛琳杨崇山刘中原柳善建董春旺
王盛琳,杨崇山,刘中原,柳善建,董春旺*
基于电特性的红茶发酵中茶多酚含量快速检测方法
王盛琳1,2,杨崇山2,刘中原2,柳善建1*,董春旺2*
1. 山东理工大学农业工程与食品科学学院,山东 淄博 255000;2. 中国农业科学院茶叶研究所,浙江 杭州 310008
茶多酚是红茶品质的重要评价指标。以工夫红茶发酵在制品为研究对象,利用电特性检测技术与化学计量学方法相结合,构建发酵中茶多酚含量的预测模型。探讨了发酵中电参数的变化规律,以及不同标准化预处理和变量筛选算法对模型的影响。结果表明,对茶多酚最敏感的电参数为并联等效电容()损耗因子()和电抗(),且集中在低频范围(0.05~0.10 kHz)。在茶多酚预测模型构建中,Z标准化(Center and zero mean normalization,Zscore)预处理、迭代空间收缩算法混合迭代保留信息变量算法(Variables combination population analysis and iterative retained information variable algorithm,VCPA-IRIV)能有效提升模型性能。VCPA-IRIV算法将引入变量数由162降低到31,压缩率达80.86%;VCPA-IRIV模型的最低交互验证均方根误差(Root-mean-squares error of calibration,)和预测均方根误差(Root-mean-square error of prediction,)分别为0.630和1.116,预测集的相关系数(Correlation coefficient of predication set,)和相对标准偏差(Relative percent deviation,)为0.941和2.956,表明电特性检测技术对红茶发酵中茶多酚含量的快速无损检测是可行的。
红茶发酵;电特性;茶多酚;变量筛选;模型
红茶是世界消费量最大的茶类,发酵是其品质形成的关键工序[1]。发酵过程中,揉捻叶细胞内以儿茶素为主体的多酚类物质与多酚氧化酶充分接触,发生酶促氧化、聚合和缩合等一系列生化反应,形成了“红叶红汤”为特征的感官品质[2-3]。多酚类物质的组成及氧化聚合程度影响红茶的汤色和滋味特征,是红茶发酵品质形成的物质基础[4]。
国内外红茶生产中,对发酵品质适度的把握,主要依据制茶师傅的经验判断,具有主观性和不稳定性。若要精准把握发酵品质,需借助理化检测手段分析茶多酚等内质成分的变化。茶多酚含量的检测,主要采用紫外分光光度法和高效液相色谱法(HPLC),存在预处理复杂、周期长、成本高等缺点,难以满足红茶自动化、规模化生产中对产品质量快速检测和在线成分含量监控的需求[5]。
电特性检测技术可直接测量样本内部的整体信息,建立待测物的电特性参数(介电常数、电容、电阻、电抗、损耗因子和阻抗)与内含生化成分的关联,具有快速、灵敏、无损、低成本的优点,已在农产品贮藏保鲜、食品加工、品质检测、筛选分级等方面显示出特殊的优势和广泛应用前景,但在茶叶领域研究较少[6-8]。Mizukami等[9]研究了不同测试频率(10 Hz~1.0 MHz)、不同嫩度的蒸青绿茶在制品的电特性参数(阻抗、电容)与水分含量之间的数学关系。胡永光等[10]分析了冷冻损伤茶鲜叶的生理指标和电参数(电容、阻抗、电阻和电抗)间的关系,并验证使用电特性表征临界寒冷温度的可行性。冯呈艳等[11]利用LCR数字电桥仪分析了不同茶树品种、原料嫩度及水分含量对物料介电常数的影响规律。Zhu等[12]基于电参数检测技术,采集了工夫红茶发酵过程中11个电参数值(测试频率为100 Hz),明确了儿茶素和茶色素与电参数存在较显著关联,并基于机器学习算法建立了4种不同红茶发酵程度(揉捻叶、未适度发酵、适度发酵和过度发酵)的定性判别模型。
总结上述文献发现,红茶发酵品质快速、无损、定量检测的研究较少,尚未有红茶发酵加工过程中对茶多酚含量的电特性检测研究报道。本文以红茶发酵在制品为研究对象,探索电特性参数与茶多酚间的量化解析关系,并筛选电参数特征变量和测试频率,结合偏最小二乘法(Partial least squares,PLS)建模方法,构建红茶发酵过程中茶多酚含量的预测模型,旨在为实际生产中精准预测发酵品质和研制专用仪器提供理论参考和依据。
1 材料和方法
1.1 样品制备
茶鲜叶原料采摘于中国农业科学院茶叶研究所嵊州市基地,茶树品种为铁观音,嫩度为一芽一叶。按照鲜叶→萎凋→揉捻→发酵→毛火干燥→足火干燥的工序加工红茶,保持各工序的工艺参数一致。发酵试验采用红茶自动化发酵机,发酵温度28℃,相对湿度≥90%,发酵时间为6 h,使样本集覆盖到不同发酵阶段(揉捻叶、轻发酵、适度发酵、过度发酵)。发酵过程中,每隔30 min取样1次,每次多点取样8个,单个样品的质量为150 g,共获取104个发酵过程样品,分别用于电特性和理化检测。
1.2 理化成分测定
对样品进行冻干和磨粉预处理,参照国标法(GB/T 8313—2018《茶叶中茶多酚和儿茶素类含量的测定方法》)测定茶多酚含量。所有生化成分的检测均重复3次,检测值以3次重复的平均值表示[13]。
1.3 茶鲜叶细胞切片方法
采用振动切片法对萎凋叶、揉捻叶和发酵3 h的在制品进行叶细胞切片,设备为VT1000S型LEICA振动切片机(北京拓普时代科技有限公司),具体操作流程如下:
(1)取材:在每组待测样中选取具有代表性的叶片沿中脉切成1 cm×1 cm正方形小块,取材要准确、迅速和新鲜,以免细胞组织发生自溶现象。
(2)固定:将切好的叶片组织迅速投入甲醛-乙酸-乙醇(FAA)固定液中,并于4℃条件下固定3 d以上,材料固定后转入15%~30%蔗糖溶液中,并置于4℃冰箱过夜,次日用于振动切片。
(3)冲洗:将固定好的材料用镊子夹出,然后用0.2 moL·L-1磷酸盐缓冲(PBS)溶液漂洗3~5次,每次10 min。
(4)包埋:将冲洗好的叶片用滤纸吸干表面缓冲液,然后插入冷却至45℃左右的3%琼脂多糖溶液中,使包埋剂完全浸没叶片组织,待冷却至室温且完全固化后用于制备切片。
(5)修块:使用解剖刀,将包埋块修整合适。
(6)切片:在切片机上固定好包埋块和切片刀,调整刀位后进行对刀、进刀,完成细修后切片,厚度在10~20 μm以上。
(7)镜检:使用镊子将制好的切片放于载玻片上,盖好盖玻片,在光学显微镜下观察试验结果,每片观察5~10个视野,拍照保存。
1.4 电特性测定
电特性检测系统由2816B型LCR电桥测试仪(常州同惠电子有限公司)、自制测试盒、自制平行电极及配套采集软件组成。电极材质为镀金铜,电极板的接触表面积均为20 cm2(长、宽、厚分别为5 cm、4 cm和1 mm)。通过终端采集软件,实现电参数信息的实时检测和自动记录,信息采集与分析流程如图1所示。
测量前,LCR测量仪开机预热30 min,并校准清零。然后称取每个待测样品50 g,均匀装入到测试盒内,再将LCR的测量电极与平行极板的外接线连接,开展样品的电参数测定。LCR测试仪的测试频率范围为50 Hz~200 kHz,测试电压设为1 V,测量在50、60、80、100、200、300、400、500、600、800 Hz和1、2、3、4、5、6、8、10、20、30、40、50、60、80、100、150、200 kHz等27个测试频率对应的电参数。
LCR的电参数测试电路分为串联、并联等效电路模型,通常低阻抗元件用串联,从数值上来说,即阻抗小于100 Ω用串联[14-15]。本试验中测试的阻抗最小值大于200 Ω,故选用并联测试电路。测试的电特性参数为:并联等效电容()、复阻抗()、电阻()、电抗()、损耗因子()和相位损耗角(),整个发酵过程中可获得104个27(测试频率)×6(电参数)的二维矩阵。
图1 电特性信息采集与分析方法流程
1.5 数据处理与分析
1.5.1 数据的标准化
各电参数的量纲和数量级不同,故对电特性参数进行标准化预处理,将电信号数据转换到同一数量级水平。本研究分别采用卷积平滑(Smooth)、多元散射校正(Multiplicative scatter correction,MSC)、离差标准化(Min-Max normalization,Min-Max)和Z标准化(Center and Zero mean normalization,ZScore)等4种方法。
1.5.2 特征变量筛选方法
电参数的全频率变量间还存在一定的相关性,某个频率点下的变量能够由其他频率点下的变量共同解释,因此该变量即为冗余信息[16]。这些冗余信息在建模时会增加模型的复杂度,降低模型的精度,所以对原始信息进行筛选十分重要[17]。本文采用经典的竞争性自适应权重取样法(Competitive adaptive reweighted sampling,CARS)和连续投影(Successive projections algorithm,SPA)、蒙特卡洛无信息变量消除(Monte Carlo based uninformative variable elimination,MCUVE),以及较新的变量迭代空间收缩算法(Variable iterative space shrinkage approach,VISSA)、混合算法-迭代空间收缩算法和迭代保留信息变量(Variables combination population analysis and iterative retained information variable algorithm,VCPA-IRIV)等算法对电参数进行特征变量筛选,并确定最优的变量选择方法。
1.5.3 建模方法与性能评价
以VCPA-PLS模型为例,为基于VCPA算法筛选的特征变量为输入,采用PLS建立茶多酚含量的线性预测模型。VCPA-IRIV-PLS模型是在VCPA算法筛选的变量基础上,用IRIV算法进一步挖掘和精简变量,最后利用经两种算法联合筛选的特征变量为输入,构建茶多酚含量的PLS预测模型(即VCPA-IRIV-PLS)。
模型建立过程中,采用交互验证法优化模型,以最低的交互验证均方根误差(Root-mean-squares error of calibration,)值确定建模的最优主成分个数。模型性能评价指标包括校正集的相关系数(Correlation coefficient of calibration set,)和,以及预测集的相关系数(Correlation coefficient of predication set,)和预测均方根误差(Root-mean-square error of prediction,)。通常值和值越小,且和值越大,模型的预测效果越好,并且和值间的差值越小,则预测模型的泛化性能越好[17]。同时,引入相对标准偏差(Relative percent deviation,)作为关键评判指标[18-19]。
建模之前,先采用Kennard Stone(K-S)法[20]从收集的104个样本中挑选出30个作为预测集,余下的74个作为校正集,预测集和校正集比例约为3∶7。所有的数据处理在MATLAB 2019a(Math Works,Natick,USA)平台下完成。
2 结果与分析
2.1 叶面显微结构变化
采用振动切片法采集萎凋叶、揉捻叶、发酵叶的细胞切片,40倍光学显微镜下的显微结构如图2所示,茶叶经揉捻后,栅栏组织和海绵组织细胞出现损伤,细胞液内的果胶质(茶汁)释放。同时,随着发酵中茶汁内多酚类物质的氧化聚合反应,形成了色素类化合物,使切片内细胞组织呈现“黄褐色”。生物体是由电介质、导体和电解质组合成的复合体,在外电场作用下,物质分子中的束缚电荷将对外加电场形成一定的响应关系[21]。红茶发酵过程中,细胞结构和成分的变化,将引起发酵中电荷阻抗能力提升,容抗能力减小[12,15]。
2.2 测试频率对电特性的影响
以27个测试频率点和13个发酵时间节点为(,)坐标轴,各电参数值为轴,绘制3因素间的影响关系的三维网络图(图3)。由图3可知,检测频率对红茶发酵样品电参数有明显的影响,且发酵时间对电参数的影响力小于频率。
由图3-A和3-C可以看出,红茶发酵样品的和值变化规律基本吻合,均随频率增大而逐渐减小,随发酵进程而逐渐增加。由图3-B和3-E可知,红茶发酵样品的和值变化规律相似,均随着测试频率的增加呈先增后降的趋势,分别在4 kHz和10 kHz附近达到峰值。由图3-D和3-F可知,红茶发酵样品的和值变化规律相反,值随测试频率的增加急剧降低,频率越低变化越剧烈,在800 Hz后趋于稳定。值随着频率的增大呈现先缓慢增加,在1 kHz后急剧下降的变化规律。
2.3 发酵时间对电特性和茶多酚含量的影响
由于发酵样品的电参数在不同测试频率,而1 kHz是本LCR测试仪高低频段的临界点,因此选1 kHz作为特征频率,进一步明确发酵时间对电特性的影响,结果如图4所示。整体来看,各电特性参数均呈现规律性变化,其中与呈先增后降趋势,、和随发酵时间逐渐增加,且损耗因子在发酵2 h后趋于稳定。和的变化曲线基本吻合,均呈四段式(0~2 h、2.5~3 h、3.5~4.5 h和5~6 h)趋势,其中0~2 h时缓慢增加,随后急剧升高。电容和茶多酚含量均随发酵时间呈线性减小趋势,表明茶多酚含量与50 Hz的电容值存在较高的相关性。
2.4 变量信息关联分析
提取13个发酵节点下各频率的值,可得一组27×13的变量矩阵,对变量矩阵进行相关性分析,并绘制相关性系数的二维热力图(图5-A)和三维切片图(图5-B)。如图5-A所示,相关性系数在低频段(50~800 Hz)与高频段(1~200 kHz)相对独立,2个波段之间的变量呈负相关,2个波段内部的变量呈正相关;低频段与低频段和高频段变量均有较高的相关性,其中高频段内部变量之间相关程度较复杂,但整体存在较高关联性。图5-B所示,各变量间的相关系数绝对值大多高于0.5,电特性数据在频率、电参数间均存在较严重的相互干扰和较大冗余,应进行特征变量的筛选和主成分提取。
图2 不同工序下的茶叶细胞切片
2.5 电参数数据预处理方法优选
采用Smooth、Min-Max、MSC和Zscore对电参数数据进行预处理,并建立茶多酚的PLS预测模型,结果如表1所示。结果表明,经Smooth、MSC方法处理后的模型与原始模型性能相当。而Min-Max和Zscore方法明显优于其他预处理方法,其中Zscore为电特性参数最佳预处理方法,其将值从原始数据的0.715提高至0.819,为1.231,也显著低于其他预处理方法。此外,Zscore模型的和的差值为0.429,在所有预处理方法中最小,表明Zscore标准化处理后使模型具备较好的泛化性能。
2.6 特征电参数筛选和线性预测模型
将27个频率下的电参数()按顺序循环排列,可得162个变量组合,利用化学计量学方法对组合变量进行筛选,提取与茶多酚成分有关联的特征变量和特征频率,以建立共线性最小、更为简洁的预测模型。发酵样品的电参数经过Zscore预处理后,分别利用MCUVE、SPA、CARS、VISSA和VCPA-IRIV等5种算法结合PLS,建立发酵过程中茶多酚含量的预测模型。
图3 电特性参数随频率和发酵时间的变化规律
图4 电特性参数及茶多酚在发酵中的变化规律
注:A为相关系数的二维热力图,B为相关系数的三维切片图
表2为各变量筛选方法优选的特征变量,表3为不同筛选方法的模型结果。由表2可知,不同方法筛选的特征变量中,尤其是排名靠前的变量,主要集中在低频段(0.05、0.08、0.1 kHz),且较相关的电参数均为和。
由表3可知,SPA、MCUVE、CARS、VISSA和VCPA-IRIV筛选的变量数分别4、22、15、47、31个,各方法均有效压缩了变量,压缩率在80%以上。对比5种变量选择方法,各方法模型的性能参数均优于全谱模型,其中VCPA-IRIV方法的结果最优,SPA、VISSA方法次之,而CARS方法则较差。较全变量的PLS模型,VCPA-IRIV-PLS模型将校正集和预测集的相关系数分别由0.857、0.819上升为0.983、0.941;及则分别由0.802、1.231下降为0.630、1.116。建模所用的变量数由162压缩为31,变量压缩率达81%,在保证模型性能前提下,有效筛选出对茶多酚敏感的特征变量。此外,VCPA-IRIV-PLS模型的为2.956(大于2.5),表明模型具有非常好的预测能力,可用于定量分析及生产实际中的品质控制。
表1 不同预处理方法对模型性能的影响
表2 不同变量选择方法筛选的特征电参数
注:*表示变量筛选方法筛选的变量数较多,并且排名较后的变量对结果影响较小,仅列出排在前10的特征变量
Note: *It means that the variable screening method screens more variables, and the lower-ranked variables have less influence on the results, and only the top 10 characteristic variables are listed
表3 不同变量优选方法所建茶多酚预测模型的结果
3 讨论与结论
本研究采集红茶发酵在制品电特性信息,表明发酵过程中电抗与损耗角呈先增后降趋势,损耗因子、电阻和阻抗随发酵时间逐渐增加,电容和茶多酚含量呈线性降低趋势,且不同测试频率、不同电参数变量间存在较高的相关性。对茶多酚变化敏感的电参数为、和,且集中在0.05、0.08、0.1 kHz等低频率范围。利用CARS、SPA、MCUVE、VISSA和VCPA-IRIV算法筛选电参数特征变量,其中VCPA-IRIV模型的性能最佳,将变量数由162个压缩为31个,仅占原变量数的19.14%。基于筛选的特征变量,构建了的茶多酚含量的VCPA-IRIV预测模型,其、和值分别为0.941、1.116、2.956,表明采用电参数可实现红茶发酵品质的快速检测。
变量优选后模型优于全变量模型的原因在于红茶发酵是以消耗多酚类物质为底物的复杂化学发应,发酵过程中酚类物质的组分、含量和比例均发生变化,导致复杂的电响应特性,使电参数信息呈现出时序性和多变性特征。适合的变量筛选方法,能够从光谱矩阵中寻找含有最低限度冗余信息的变量,在一定程度上集中和提高了电信号与目标成分的关联。同时,VCPA-IRIV是一种考虑了所有变量组合效应的新型混合算法变量,可剔除大量干扰变量和共线性信息,基于筛选的特征电参数,使茶多酚含量的定量预测模型性能有显著提高。
此外,Li等[22]开展了基于近红外光谱的茶多酚含量预测模型,最优回归模型验证相关性为0.905,均方根误差为1.027,能测定14个茶树品种中茶多酚含量。将本研究的电特性模型预测结果与之比较,结果表明,两种模型的和值相当,电特性法略优于近红外光谱法,均能较好检测红茶的茶多酚含量。但近红外光谱检测点为红茶样品的表面,而电特性检测样品为堆积状,模型结果更能反映样品的整体信息而非叶面变化,更符合生产工艺技术要求。本研究结果为红茶品质的在线动态监控及数字化、智能化加工设备的研发提供了理论依据和技术支撑。
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Rapid Detection Method of Tea Polyphenol Content in Black Tea Fermentation Based on Electrical Properties
WANG Shenglin1,2, YANG Chongshan2, LIU Zhongyuan2, LIU Shanjian1*, DONG Chunwang2*
1. School of Agricultural and Food Engineering, Shandong University of Technology, Zibo 255000, China; 2. Tea Research Institute, The Chinese Academy of Agricultural Sciences, Hangzhou 310008, China
Tea polyphenols are an important evaluation index for the quality of black tea. The quantitative prediction model of tea polyphenol content in the fermentation process was established by combining electrical characteristics detection technology with chemometric method. The changes of electrical parameters during the fermentation process and the influence of different standardized pretreatment methods and variable optimization algorithms on the model were discussed. The results show that the most sensitive electrical parameters to tea polyphenols were,and, all of which were concentrated in the low frequency range (0.05-0.10 kHz). In the construction of tea polyphenol prediction model, normalization processing (Zscore) and mixed variable screening (VCPA-IRIV) can effectively improve the performance of the model. The number of variables introduced in the VCPA-IRIV-PLS model was reduced from 162 to 31, and the compression rate reached 80.86%.andwere reduced to 0.630 and 1.116, respectively.andwere increased to 0.941 and 2.956. The research results show that the electrical characteristics detection technology is feasible for the rapid non-destructive detection of the content of tea polyphenols in black tea fermentation.
black tea fermentation, electrical characteristics, tea polyphenols, variable screening, model
S571;TS207.3
A
1000-369X(2021)02-251-10
2020-11-09
2021-01-19
国家自然科学基金(31972466)、中央级院所科研基本业务专项(1610212016018)
王盛琳,硕士研究生,主要从事农产品加工技术研究。*通信作者:liushanjian08@163.com;dongchunwang@163.com
(责任编辑:黄晨)