温度胁迫下昆虫表观遗传机制的研究进展

王晓迪，冀顺霞，申晓娜，刘万学，万方浩，吕志创

（中国农业科学院植物保护研究所/植物病虫害生物学国家重点研究室，北京 100193）

温度是限制物种适应性分布的重要因子，决定着物种的分布和扩散区域。自然界中，不同的物种分化出不同的生态位。受全球气候变化影响，区域气候变化，特别是气温上升的影响，陆地生态系统的生物分布将发生巨大改变，并将影响物种的扩散和发生成灾。Deutsch等[1]预测了2100年全球变暖导致不同地理区域的生物丰富度的变化情况，其中热带地区的物种丰富度将显著降低，许多物种将面临濒临灭绝的危险。昆虫是变温动物，对温度变化十分敏感，对环境温度的胁迫调节能力是决定其地理分布和发生危害的重要因素[2]。温度胁迫下，昆虫会通过一系列的生理代谢的调节以及基因应激表达等方式应对外界的温度胁迫。如体内含水量降低；细胞环境发生变化；细胞膜的流动和生物大分子空间构象改变；酶活性和脂、糖类物质合成代谢速率发生改变；体内营养物质（膜脂质、磷脂组分、糖或多羟基化合物）的浓度发生变化。同时，昆虫体内编码热激蛋白的基因和编码其他胁迫蛋白的基因的表达量也会发生变化。事实上，昆虫温度胁迫响应是个复杂的生理过程，也是个多基因参与表达和调节的过程[3-6]。随着全球气候变化及温室效应的加剧，昆虫自身也在快速适应温度变化，因此为明确昆虫快速响应外界逆境温度的适应能力，科学家们在探究基因功能的同时，从表观遗传（epigenetics）的角度为切入点揭示其温度适应性机制。研究表明，表观遗传过程可能会增加生物体应对非生物胁迫和其他环境挑战的进化潜力[7-11]。

表观遗传最早于20世纪40年代由胚胎学家和发育生物学家Waddington提出，即研究基因与决定生物表型的基因产物间的关系[12]。1975年，Hollidy和Pugh[13]认为表观遗传是一种非DNA序列差异决定的核遗传。目前广泛认为表观遗传是指在同一基因组上建立的能将不同基因转录和基因沉默模式传递下去的染色质模板变化的总和[14]，强调表观遗传是一种被动的响应而非主动的改变，是一种基因相同而基因表达模式不同的过程。它研究的遗传机制不涉及DNA序列的改变，而是涉及基因表达的重新编程，以响应内源性和环境刺激[15]。表观遗传学与遗传学的不同之处在于：一方面，表观遗传过程可能提供第二遗传系统，类似于遗传系统，允许通过自然选择进行进化。另一方面，表观遗传变异与遗传变异不同，前者可通过生态相互作用直接发生，因此表观遗传变异为物种适应新的环境提供了一个额外的进化途径[16]。表观遗传变异可由环境变化自主产生，对重要的生态性状具有表型可塑性[17,18]。表观遗传修饰会通过有丝分裂和减数分裂遗传给下一代，当逆境胁迫消失后，其调控能力仍然存在，一旦逆境再次出现，就能对外界的恶劣环境迅速做出应激反应[19]。总之，与经典遗传学不同，表观遗传学不改变DNA序列响应环境变化而对基因表达产生快速而持久的影响[20,21]，为表型和基因型的关系提供了一种合理的解释机制[15,22]。表观遗传的调控机制主要包括 DNA甲基化、组蛋白修饰、染色体重塑和非编码 RNA，且这四种调控机制之间存在交互作用。

随着表观遗传学的发展，越来越多的研究发现表观遗传在生物体响应环境胁迫中起着重要的作用。对于昆虫的表观遗传学问题应该是一个全新的研究挑战，它可以用来解释一些在自然种群中观察到的不能用物种间 DNA序列的差异来解释的遗传表型变异[23,24]。表观遗传诱导的表型变异是一种可逆的改变，这种改变可以调控生物体对环境波动的快速响应，从而提高生物对环境胁迫的适应能力[25-27]。而温度作为环境因素中的重要因子，使得由表观遗传调控的生物体温度适应性机制也引起了广泛关注。温度变化可以影响生物体的表观遗传模式以及与表型变异相关的表观遗传修饰。因此，从表观遗传的方向出发能有效帮助我们深入理解昆虫为抵御逆境而做出的自然变异机制。本文从DNA甲基化、组蛋白修饰、染色质重塑、非编码RNA调控等方面简要阐述了表观遗传调控在昆虫响应温度胁迫中的影响及研究进展。

1 DNA甲基化调控昆虫响应温度胁迫

DNA甲基化是指在DNA甲基化转移酶（DNA methyltransferases，DNMTs）的作用下将甲基添加在DNA分子中的碱基上，这是一种极为常见且重要的表观遗传现象。DNA甲基化作为表观遗传学最为重要现象之一，对基因的表达发挥着重要的调控作用，在昆虫响应温度胁迫等逆境的过程中发挥了关键性作用。在对家蚕Bombyxmori的研究中发现，家蚕在饲养的过程中其体内的甲基化细胞酶比野生蚕Bombyx mandarina高出两倍，表明家蚕在驯化过程中DNA甲基化有增加的趋势，并验证了Dnmt1甲基转移酶基因在家蚕胚胎发育中具有重要的功能[28]；在对蜜蜂Apismellifera全基因组亚硫酸氢盐测序（BS-seq）数据的无偏分析中不仅发现了CG位点处DNA甲基化在外显子中富集，同时发现了非CG位点的胞嘧啶甲基化和羟甲基化在内含子中富集的现象[29]；对寄生蜂Nasoniavitripennis全基因组DNA甲基化研究发现大多数（99.7%）甲基化位点发生在胞嘧啶上，其次是 3′方向的鸟嘌呤（CpG位点），在所有位点中有0.18%的位点和在CpGs位点中0.63%的位点发生甲基化[30]。以上对昆虫全基因组甲基化分析表明，5-甲基化胞嘧啶是常见的DNA甲基化修饰形式。DNA甲基化的变化被认为与表型可塑性有关，这是植物和动物适应不同环境的重要前提。

Ardura等[31]研究阐明了无脊椎动物甲基化模式的变化，其中在入侵种侏儒贻Xenostrobussecuris中检测到甲基化水平显著降低，并认为该响应模式是一种快速增加表型可塑性的方法。同时DNA甲基化已被证实存在于双壳类动物中，且低水平的DNA甲基化会增加反逆转录机会并增强转座子的活性，有利于入侵种快速适应新环境[32]。对海洋入侵种Cionasavignyi进行研究发现总DNA甲基化水平在各处理组间差异很大，24 h后对照组的甲基化水平为12%，而高温胁迫下甲基化水平为32.6%，该试验表明应激诱导的DNA甲基化有助于个体在入侵过程中的快速适应[33]。甲基化敏感扩增多态性（methylation sensitive amplification polymorphism，MSAP）可快速有效筛选DNA甲基化的变异[34]，通过该方法来评估温度胁迫和盐胁迫诱导的入侵物种海鞘Didemnumvexillum的DNA甲基化变化，发现DNA甲基化在适应性特征的可塑性中起着关键作用[35]。Ni等[36]对入侵种Cionarobusta和Cionaintestinalis的研究发现这两种物种种群中甲基化多样性和甲基化分化均十分显著，经分析表明DNA甲基化变异是由遗传变异和环境因素共同导致的。Chen等[37]通过检测Cionarobusta体内与温度和盐度适应有关的适应位点和候选基因，并指出快速的微进化导致了其对胁迫环境的适应。Li-Byarlay等[38]运用RNA干扰（RNAi）技术，降低了DNA甲基转移酶3（Dnmt3）的表达，通过试验证明DNA甲基化具有调节选择性剪接的功能，该功能可增加基因表型的多样性和复杂性[39]，从而表现出物种特异性，同时有助于理解表型可塑性的机制和进化。以上研究结果展示了DNA甲基化作为表观遗传调控的一种方式，在物种入侵及环境的适应中发挥了关键作用。

研究发现DNA甲基化在生物体的表型可塑性及响应环境温度胁迫中也起到重要的作用。温度胁迫诱导的DNA甲基化水平和模式的改变能影响生物体的基因表达和正常发育。如三刺鱼Gasterosteusaculeatus中25%的差异甲基化区域与其发育阶段温度调控以及性成熟个体的温度适应性密切相关[40]。根据全球变暖模型预测的温度升高能诱导鱼类特定发育阶段全基因组DNA甲基化水平的改变，以影响与环境胁迫相关基因表达水平[41]。温度胁迫诱导的甲基化模式的改变还可以调节生物体的性别：如欧洲鲈鱼Percafluviatilis温度诱导能改变其性腺中 cyp19a启动子的甲基化水平，从而影响鲈鱼的性别比[42]。此外，温度能影响海龟Lepidochelysolivacea的双向性腺中DNA甲基化模式，调控性别相关的Sox9基因的表达，从而使双向性腺发育成为卵巢或者精巢[43]。在赤拟谷盗Triboliumcastaneum中DNA甲基化的改变能影响异染色质结构的重塑从而参与高温胁迫响应[44]。在包括一些蚂蚁和白蚁在内的其他昆虫的基因组中也发现了DNA甲基化[45,46]，并与种性分化和行为成熟有关[47,48]。

生物体还能直接通过改变DNA甲基转移酶（Dnmts）基因的表达模式来调节生长发育和响应温度胁迫。敲除西方蜜蜂Apismellifera的Dnmt3基因，会导致饲喂普通食物的新孵化的幼虫与饲喂蜂王浆的幼虫一样发育成具有成熟卵巢的蜂王[49]。Dai等[50,51]研究发现DNA甲基化转移酶Dnmt1和Dnmt3基因在入侵种烟粉虱BemisiatabaciMED隐种的耐温性中起重要作用，是其入侵后能适应不同区域气候的原因之一。高温可以显著提高北京鸭Anasplatyrhynchosdomestica在胚胎发育期间腿肌的Dnmt1和Dnmt3a的活性，说明孵育温度能直接影响北京鸭早期胚胎发育阶段DNA甲基化的变化[52]。此外，Skjærven等[53]发现大西洋鳗鱼Atlanticcod体内的Dnmt1对短时温度胁迫极其敏感，在遭受温度胁迫后其表达量显著降低。此外，在斑马鱼Barchydanioreriovar早期发育过程中Dnmt3a/3b基因表达的改变能影响与温度调控相关基因的表达从而更好地响应温度胁迫[54]。

2 组蛋白修饰调控昆虫响应温度胁迫

组蛋白是核小体中的重要组分，其以H2A、H2B、H3和H4四种组蛋白，各两份拷贝，共同形成一个致密的八聚体结构。无论在结构简单的酵母中还是复杂的高等生物中，组蛋白在其序列与修饰状态上均是高度保守的。组蛋白修饰（histone modification）是一种翻译后修饰（PTM，posttranslational modification），是指组蛋白在相关酶作用下发生乙酰化、甲基化、磷酸化、腺苷酸化、泛素化、ADP核糖基化等修饰的过程。这些过程通过影响组蛋白与DNA双链的亲和性，来调控靶基因的表达，进而产生基因功能上的变化。

组蛋白修饰在基因的转录、表达的启动、修复、修饰等方面都具有很重要的作用。乙酰化组蛋白形成一种松散且易接近的染色质，可以促进基因表达，而去乙酰化组蛋白与DNA的结合更紧密，使其难以接近且在转录上沉默。组蛋白的这种性质是由两个酶家族的相反活动控制的：组蛋白乙酰转移酶（HATs）和组蛋白去乙酰化酶（HDACs）[55]。组蛋白甲基化对转录的激活或抑制作用取决于所添加的甲基团数目以及存在甲基化的lys位点。研究发现果蝇组蛋白甲基转移酶G9a（dG9a）是获得饥饿胁迫耐受性的关键因子，在饥饿诱导的自噬过程中发挥着重要作用[56]。组蛋白的磷酸化也是一种十分重要的调控方式，在DNA修复、基因转录、染色质凝聚及细胞凋亡过程中起着重要的作用。组蛋白H3 磷酸化是信号转导通路、基因调控和生物过程的重要下游信号转导事件[57,58]。研究显示，H3S28A突变体对果蝇会产生以下影响：平均寿命增加近70%，百草枯饲养模型中对食物戒断的抵抗力增强，对氧化应激条件的抵抗力增强[59]。核糖化是指组蛋白H1、H2A、H2B及H3和多聚ADP-核糖的共价结合，研究发现真核细胞复制过程中发挥扳机作用的是ADP-核糖基化。而泛酸化是指将被降解的蛋白质连接上泛酸标记，事实表明，被修饰的H2B组蛋白可以启动基因表达；类泛酸蛋白（small ubiquitin-like modifiers，SUMO）对蛋白质的翻译后修饰与蛋白质的细胞内定位、转录活性和稳定性均有关。

研究表明，组蛋白修饰参与了生物体的胁迫应答过程[60-66]。如对拟南芥Arabidopsisthaliana研究发现，组蛋白去甲基化酶JMJ17在植物干旱胁迫和脱落酸应答过程中起负调控作用[67]。在拟南芥中，由茉莉酸途径介导的病原菌胁迫，去乙酰化酶HDA6与HDA19在响应胁迫的过程中发挥了关键性的作用，此外，HDA6还能对环境中的低温胁迫做出应答[68]。低温处理春化过程中的拟南芥，会诱导相应的组蛋白修饰，从而抑制植株内FLC（flowering locus C）基因的表达，且这种抑制能够持续至拟南芥开花[78]。在拟南芥春化过程中低温处理会诱导组蛋白修饰，将VRN3（vernalization insensitive 3）募集到与FLC相关的VRN2（vernalization insensitive 2）蛋白复合物上，抑制FLC基因，并一直持续至开花[69,70]。对番茄进行干旱胁迫处理会引起其组蛋白上的特定基因的表达，从而影响其叶片的气孔开合以及呼吸速率[71]。此外，研究发现，HDA4和HDA5负调控番茄的高温抗性，HDT2和SRT1正调控番茄的高温抗性，去乙酰化酶SRT1正调控番茄的低温抗性[72]。又如，组蛋白去乙酰化酶基因TaHDA19可以增强小麦Triticumaestivum的耐热性[73]。水稻Oryzasativa在经过热激和冷激处理后，其体内多个组蛋白修饰相关基因（OsHAC701、OsHAG702、OsHAM701，OsHAC704）的表达发生了显著变化，这表明该类蛋白在温度胁迫反应中发挥着重要的表观遗传调控作用[74]。在对家鸡Gallusgallusdomesticus的研究中发现，组蛋白去甲基化与其温度耐受性相关[75]。对模式昆虫果蝇的研究发现，黑腹果蝇Drosophilamelanogaster耐热性的降低与其体内组蛋白生物素化水平的降低有关，敲除全羧化酶合成酶（holocarboxylase synthetase，HCS）会引起组蛋白中生物素化的减少，从而导致黑腹果蝇寿命及耐热性的降低[76]。研究建立了果蝇组蛋白乙酰化修饰、HSP的表达以及寿命调控三者之间的有机联系；初步阐述了组蛋白乙酰化修饰调控hsp基因表达的分子机制，进而揭示果蝇热激诱导反应速度以及较强的高温抵抗性[77]。组蛋白乙酰转移酶Elp3在赤拟谷盗对氧化胁迫的适应性方面起到重要作用[78]。由此可见，组蛋白修饰在生物适应环境温度刺激的过程中具有重要作用。

3 染色质重塑调控昆虫响应温度胁迫

染色质重塑（Chromatin remodeling）是指染色质结构和位置发生了变化，其主要涉及核小体在能量驱动下的重新排列和置换，从而导致基因启动子区核小体的排列方式发生了改变，增加了启动子和基因转录装置的可接近结合性。表现为染色质紧密的超螺旋结构限制了转录因子对DNA的接近与结合，从而抑制了基因的转录过程；而开放式的疏松结构，使转录因子等更易接近DNA，进而促进基因的活化和转录[79]。染色质重塑在基因转录、细胞周期发展、DNA复制、重组和损伤修复中具有至关重要的作用[80-88]。染色质重塑主要包括两种类型：一类是依赖ATP的物理修饰，即利用ATP水解后释放的能量将DNA和组蛋白的结合分开，使转录能够顺利进行下去；另一类是含有组蛋白脱乙酰酶和乙酰转移酶的化学修饰类型，即依靠水解ATP来提供所需的能量，使染色质重塑复合物可以完成染色质结构的改变。

染色质重塑复合体（Chromatin remodeling complex）在染色质重塑过程中发挥着重要作用，它们通过移动或改变核小体的位置使得DNA片段释放出来用于转录，并且在转录完成时再次进行压缩。鉴于所有的这一切都是以高度动态的方式发生的，染色质重塑蛋白复合物让细胞能够快速地对它们的环境中的变化作出反应，这种调控机制在进化上非常保守，从酵母到人都是如此[89]。根据亚基的组成和生物活性的不同，染色体重塑复合物主要分为 4个家族：SWI/SNF（mating-type switching/sucrose non-fermenting）、ISWI（Chromatin remodeling by imitation swith）、INO80、CHD和ATRX复合物[90]，SWI/SNF是第1个被发现的ATP依赖的染色质重塑复合物[91]。

生物体抵抗高温或低温等环境胁迫的能力依赖于其自身调控胁迫应答基因表达的机制[92]。而染色质重塑是调控基因表达的重要手段，研究表明染色质重塑可以直接或间接影响生物体的温度耐受性[93-96]。对拟南芥的研究表明，染色质重塑因子如SWI/SNF家族的BRM和CHR12基因以及CHD家族的PKL等，均参与其高温胁迫响应[97-101]；SWI/SNF的过表达使拟南芥在高温胁迫下表现出花芽以及初生茎生长停滞现象[102]。果蝇中的研究发现，ISWI染色质重塑因子可以与GAGA因子协同作用，从而促进热激蛋白基因的转录[103,104]，进而提高其温度耐受性。最近，利用RNAi对烟粉虱BemisiatabaciMEAM1（Middle East-Asia Minor 1）隐种的ISWI基因进行了研究，通过饲喂BtISWIdsRNA后发现MEAM1成虫的平均耐热时间显著缩短，并因此证实了BtISWI在MEAM1的耐热性中起重要作用，且可能参与MEAM1的温度调节[105]。

4 非编码RNA调控昆虫响应温度胁迫

非编码RNA( Non-coding RNAs) 是指该RNA分子不能翻译为蛋白质。目前我们熟悉的非编码RNA被分为三大类，它们都介导了基因抑制：微小RNA（microRNA，miRNA）、小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）和PIWI-interacting RNAs（piRNAs）[106-108]。这些RNA的成熟形式是由20～30个核苷酸分子组成，它们与Argonaute （AGO）超家族蛋白的一个成员有关，而Argonaute超家族蛋白是RNA干扰（RNAi）通路的中心效应因子[109-111]。miRNAs和siRNAs通常被称为转录后基因沉默因子，引导AGO复合物在细胞质中互补mRNA，诱导转录产物降解并阻断翻译[112]。siRNA是在DCL（Dicer-like protein）酶作用下由长双链RNA前体加工而来，miRNA是内源基因编码的一类能与靶mRNA互补配对的一种单链小RNA，主要参与基因的转录后调控。

非编码RNA在生物体内的表达模式具有多样性，在各种各样的发育和生理过程中都发挥重要的作用，包括参与生殖细胞和干细胞分化[113]、参与器官的发育[114]、调控生命体的生长发育[115]和调控细胞凋亡[116]等。此外，还具有组织特异性，参与一些昆虫特有的生理过程，如昆虫节律行为的调控[117,118]、昆虫变态发育[119]、社会性昆虫多态现象[120]以及昆虫的表型可塑性[121,122]等。

此外，非编码在调控生物体对逆境胁迫的响应中也起着重要作用。在全球变暖的环境背景下，生物体可以通过miRNA的表达来迅速地响应温度胁迫，从而更好地适应新的环境[123]。在稻水象甲Lissorhoptrus oryzophilus[124]、松材线虫Bursaphelenchusxylophilu[125]和小麦[126]体内都发现了与温度胁迫相关的miRNAs的表达变化。表明miRNA作为一类新型调控因子可能参与生物体的基因表达调控及对温度胁迫的响应。又如，高温胁迫会导致比目鱼Senegalesesole体内与肌肉生成相关的miR-17a、miR-181-5p和miR-206-3p的表达上升以及与脂类代谢和能量产生相关的 miR-181a-3p的表达下调来促进幼仔的生长发育，说明miRNA在温度诱导的生长发育表型可塑性中起重要的作用[127]。Lyons等[128-130]对抗寒性昆虫瘿蚊Epiblema scudderiana的研究表明，其能通过体内miRNAs的表达更好地响应低温胁迫。研究发现miR-7与光感受器及本体感受器缓冲外界环境变化与压力相关，当黑腹果蝇幼虫遭到剧烈温度变化时，miR-7突变会造成yan基因、本体感受器及嗅觉sop基因表达的不规律，表明当其处于逆境时miR-7通过调控基因的表达防止发育系统的异常从而维持机体调控的稳定性[131]。而雌性果蝇体内的 miR-8也可以通过调控成虫表皮的色素分布来增强果蝇的热敏感性，说明在遭受温度胁迫后，miR-8在维持基因表达稳态方面也起重要作用[132]。对黑腹果蝇的研究还发现，高温处理可以改变piRNAs的表达，并使得转座子修饰活性发生改变[133]，最终发生基因变异以及表型可塑性的变化[134]。

中国科学院分子植物科学卓越创新中心/植物生理生态研究所何祖华研究组与中国科学院遗传与发育生物学研究所曹晓风研究组合作研究，共同揭示了小分子RNA参与的植物响应高温胁迫的复杂表观遗传调控的网络关系[135]，这给我们在昆虫相应逆境的研究提供了一些启发，可将生物化学、分子生物学与遗传学相结合，更加有利于我们确定高温可以激活哪些转录因子，并使昆虫出现相应的响应逆境的表型。表观遗传学可以从更微观、更深刻的角度出发，带领我们开拓昆虫响应温度胁迫的新视野。

5 结论与展望

对压力条件的适当反应是生物体适应环境挑战的重要因素，表观遗传学是研究在不改变DNA序列的情况下，生物响应逆境的过程中快速而持久的基因表达，因此对这些条件作出反应的表观遗传学调控越来越受到关注。未来将进一步对昆虫响应逆境的内在机制进行更深层次的研究与讨论。研究和开发配套的表观遗传模型及新技术，将有助于我们更好地评估表观遗传变化对快速适应环境变化的重要性，为揭开更多表观遗传的机理提供更加广阔的研究前景。非生物胁迫尤其是随着全球气候变暖的加剧，使得昆虫对环境的适应面临着巨大的挑战。但非生物胁迫作为一种动态的变化过程，在研究表观遗传机制对昆虫的作用时必然会面临一些困难。接下来我们的研究应该尝试去解决以下几个方面的问题：（1）昆虫在响应逆境时基因是如何表达的，如何确定修饰因子及位点。（2）表观遗传调控的方式是多种多样的，应从不同的方面开展研究，并对复合物进行鉴定。（3）在明确一系列表观遗传机制后，如何有效地运用，有效阻止外来生物入侵。

研究表观遗传机制及其与外界压力适应的关系，在一定程度上能够帮助我们理解昆虫在适应逆境的过程中进化的情景，通过对表观遗传的研究，我们可以更深刻地了解昆虫对逆境的响应，以及在DNA序列不改变的情况下，表观遗传修饰对逆境的快速适应机制是如何运行的。并通过采取有效的措施，加以控制，这对保护本地物种、防止外来生物入侵都具有重要意义。但就目前的研究成果来看，对昆虫的表观遗传机制的研究还需展开更深入的探索。