原代细胞在人用狂犬病疫苗中的应用及研究进展

石磊泰 综述，李玉华 审校

中国食品药品检定研究院，北京102629

据考证，公元16世纪，我国明朝隆庆年间已有种痘的医书记载，将天花患者康复后的皮肤痂皮磨碎成粉，吹入未患病的儿童鼻腔即可预防天花［1］。19世纪70年代，病原菌的发现推动了疫苗免疫学的研究。1882年，巴斯德从牛脑分离到1株狂犬病病毒，在家兔脑内连续传90代后驯化为固定毒，将感染固定毒的家兔脊髓取出后干燥减毒，给狗免疫后能预防狂犬病。1885年，巴斯德用这种疫苗成功救治了一名被疯狗咬伤的9岁男孩，这一举措开启了人用狂犬病疫苗预防狂犬病的新纪元［2-3］。巴斯德发明的这种狂犬病疫苗其实是一种依赖神经组织培养的疫苗，半个多世纪的应用出现了众多因神经组织残留而引起的变态反应，因此，人们开始尝试采用非神经组织培养狂犬病病毒。

用于病毒培养系统的发展为疫苗生产的模式转变铺平了道路，原代细胞直接来源于动物，保留了其来源组织的特性，不具有致瘤特性。它们不被储存或只作为细胞库在有限的范围内被储存。本文就原代细胞在人用狂犬病疫苗中的应用及研究进展作一综述。

1 鸭胚疫苗

病毒学家在20世纪30年代取得了突破性进展，他们发现培养多种动物病毒的一种经济、简便的方法是禽胚技术。这项技术有如下优点：可用性，易于操作，胚胎存在自然无菌环境；胚胎无法产生针对用作接种物的病毒的抗体；胚胎具有相对统一的遗传结构。

1955和1956年，PECK等［4-5］为进一步避免引起变态反应的事故，又研制了用鸭胚制备的疫苗（DEV）。系用固定毒接种7日龄鸭胚卵黄囊，培养12~14 d，取胚制成40%悬液并用β-丙内脂灭活。这种疫苗在美国和其他许多国家广泛应用达27年，多数用于感染前预防。据报道，中和抗体水平不如脑组织疫苗。自1958—1975年共发生21例神经并发症，死亡2例。在全程免疫中其发生率为1∶25 000，但局部反应和一般全身副反应几乎所有接种者均有发生。由于抗体应答低，效果未能肯定，以及二倍体细胞疫苗的成功开发，1981年起，美国及其他国家不再生产和使用这种疫苗。

在伯纳的瑞士血清和疫苗研究所开发了一种高纯度的狂犬病疫苗［6-7］，该疫苗具有高含量的有效狂犬病病毒糖蛋白抗原，新疫苗是从鸭胚（PDEV）衍生而来的。根据世界卫生组织针对强效狂犬疫苗推荐的暴露后时间表进行的免疫（在第0、3、7、14、28和90 d进行6次注射）已在第14天诱导出保护性抗体滴度（大于1 IU／mL）。最新的放射免疫法的使用并未揭示新狂犬病疫苗中髓鞘碱性蛋白的存在。由于狂犬病疫苗PDEV的制备有所改进，是一种经济高效的疫苗，仅涉及极少的疫苗后脑炎风险。

1983年，世界卫生组织曾提倡使用胚胎卵作为生产平台［8］，但使用胚胎蛋仍有许多局限性，包括供应不足的风险、产量不一致的耗时过程、制造成本高以及对鸡蛋成分可能产生过敏反应［9］。从母公司瑞士伯纳生物技术公司转让技术后，印度于2001年开始大规模生产并使用这种疫苗［10-11］，但目前已停产［12］。

2 鸡胚细胞疫苗

1965和1978年，日本的KONDO［13-14］用Flury HEP株适应原代鸡胚细胞制成冻干纯化鸡胚细胞疫苗PCECV，1980年由日本批准应用，主要在日本和东南亚一些国家使用。1984年，联邦德国Behring厂用Flury LEP株适应鸡胚细胞制成PCECV，并注册商标Rabipur®，现已广泛应用。PCECV在全球范围内以Rabipur的形式销售，但有一些例外：在南非和纳米比亚以Rabipor销售（于2000年获得许可），在美国和加拿大称为RabAvert（分别于1997和2003年获得许可）。

Rabipur是采用Flury LEP狂犬病病毒在鸡胚细胞上培养，用β-丙内酯灭活，通过连续密度梯度离心法，用聚明胶做稳定剂，再冻干制成［15］。Rabipur由通过世界卫生组织预认证［16］的制造工厂生产：德国马尔堡和印度安克雷什瓦。在德国马尔堡，一个新的最先进的Rabipur制造厂已于2014年获得批准。来自这两个工厂的数批Rabipur已被证明具有临床可比性：印度生产的疫苗与德国生产的疫苗在免疫原性和耐受性方面均无劣效性［17-18］。

Rabipur不仅可通过肌肉免疫诱导免疫反应，还能通过皮内途径刺激类似的免疫反应。皮内途径注射在国家卫生当局认可的流行区、发展中国家为狂犬病疫苗的可负担性作出了重大贡献［19］。

Rabipur是第一种纯化的鸡胚细胞培养疫苗，1984年在德国获得许可，后续在全世界60多个国家获得许可。Rabipur的免疫原性、有效性和安全性已在大量暴露前和暴露后临床试验中通过肌内和皮内免疫途径进行了评估，试验人群包括成人和儿童，健康志愿者和被实验室证明的狂犬病动物咬伤者，营养不良的儿童和免疫功能低下人群。在过去30年中，使用Rabipur进行的广泛的全球临床经验表明，该疫苗具有免疫原性，有效且通常具有良好的耐受性［20］。

CTN-1株由中国食品药品检定研究院建株和保存，是WHO和我国有关部门批准用于疫苗生产的毒株［21］，研究表明，相对其他疫苗生产株，CTN-1疫苗株与国内多数流行野毒株的基因同源性较高，对我国流行株具有普遍的保护作用［22］。

有研究者分析了狂犬病病毒CTN-1株在鸡胚细胞驯化过程中的特性［23-25］。利用RT-PCR反应扩增CTN-1株19个代次的G蛋白基因，获得cDNA进行序列测定；并以免疫荧光法测定各代次毒株在细胞中的滴度。序列测定结果显示，CTN-1株在鸡胚细胞驯化过程中G蛋白基因序列发生不同程度变异且逐步积累，从第30代开始，G蛋白基因序列趋于稳定。与CTN-1株相比，鸡胚细胞驯化株在G蛋白的第147、333、389、421和485位氨基酸发生了突变。与此相对应，CTN-1株鸡胚细胞驯化株滴度逐渐趋于稳定，并于第33~58代滴度维持在7.0~7.5 lgFFU／mL。G蛋白同源性分析表明，CTN-1株鸡胚细胞驯化株与我国近期不同区域分离得到的街毒株具有较高的同源性，其G蛋白氨基酸序列同源性为89.3%～99%。CTN-1株在鸡胚细胞驯化过程中G蛋白基因发生稳定变异，滴度在传代后33~58代达到较高水平，稳定性较好。将CTN-1株在鸡胚细胞的适应株命名为CTNCEC25株。

王春华等［26］初步证实，CTNCEC25株是1株高度减毒、不易返祖的弱毒株，其在鸡胚细胞上可稳定、快速增殖，病毒滴度高（＞107.0FFU／mL），是1株安全性较高的狂犬病疫苗候选毒株。研究狂犬病病毒CTNCEC25株的增殖能力、病毒的感染力及致病力等表型特征，为将该毒株应用于疫苗生产提供基础信息。将CTNCEC25株及其母株CTN-1分别接种Vero细胞、原代鸡胚成纤维细胞（primary chick embryo cell，CEC）和小鼠神经瘤母细胞（moue neuroblastma N2a cell，N2a），观察其细胞病变特性及其复制规律；以脑内注射的方式接种动物，观察其对乳鼠、小鼠、豚鼠及家兔的致病力；同时还将CTNCEC25株在CEC上连续传20代，在乳鼠脑内传3代，观察其增殖能力、病毒感染力及致病力的稳定性。研究结果表明，与母株CTN-1株相比，CTNCEC25株在Vero细胞和N2a细胞上的增殖并无显著差异，但在CEC上，CTNCEC25株具有明显优势，其72 h滴度可达107.5～7.6FFU／mL，而CTN-1株滴度只有105.8FFU／mL；此外，CTNCEC25株在N2a细胞、Vero细胞及CEC上均可产生明显的细胞病变。脑内致病力实验结果表明，CTNCEC25株虽然对1~3日龄乳鼠仍具有较强的脑内致病性，但对成年小鼠的脑内致病力大大减弱，对豚鼠和家兔不致病。经细胞和乳鼠脑内连续传代，CTNCEC25株在CEC上增殖稳定，其减弱的毒力并未回升，无弱毒返祖现象。

郭采平等［27］对CTNCEC25株在鸡胚细胞（chick embryo cells，CECs）上的培养工艺进行探索和研究，以M199为基础培养基，分别加入人血白蛋白、胎牛血清及HEPES缓冲液，并均加入碳酸氢钠，配制培养基M1、M2和M3。将驯化获得的CTNCEC25株按1∶5 000的比例接种于CECs悬液中，在不同培养条件下，通过单因素试验初步确定培养基配方、培养温度、接种MOI及培养时间4大工艺参数范围，再以正交试验确定上述条件的最佳组合。单因素试验初步确定的工艺参数为：采用M2或M3培养基，培养温度33~36℃，MOI=0.01~0.001 FFU／细胞，培养时间72~120 h，可获得较高的病毒滴度（7.0 lgFFU／mL以上）。正交试验确定的最佳工艺条件为：采用M3培养基，培养温度33℃，MOI=0.01 FFU／细胞，培养时间120 h，该工艺参数获得的病毒滴度可达7.5 lgFFU／mL。优化了CECs培养RV的工艺，CTNCEC25株的病毒滴度由约6.0 lgFFU／mL提高至7.0 lgFFU／mL以上，为疫苗生产获得理想抗原量奠定了基础。

3 原代狗肾细胞疫苗

1978年，荷兰学者VAN WEZEL等［28］研制了一种原代狗肾细胞疫苗，生产用毒种为巴斯德PM人二倍体细胞适应株。用6~9周龄beagle狗肾经胰酶消化后制成细胞，液氮冻存，建立原代狗肾细胞库。用第2代细胞制备疫苗，细胞培养于含微载体的40立升培养瓶内，37℃培养6~8 d，细胞浓度达106个／mL时接种病毒，置35℃再培养6 d，经洗换后，间隔4~5 d收获病毒液。病毒感染滴度为105.1~107.3LD50／mL。病毒液经浓缩纯化后，用β-丙内脂灭活，加5%乳糖为稳定剂制成冻干疫苗。在荷兰用于人体暴露前和暴露后接种的观察结果显示，具有良好的效果并可与人二倍体细胞疫苗（HDCV）相比，但疫苗未大量生产和应用。

UYTDEHAAG等［29］在1983年报道了一种用于获得针对狂犬病病毒（DKCV）狗肾细胞疫苗的人类辅助抗体应答的体外方法。DKCV在体外刺激了来自正常狂犬病免疫和非免疫供体的外周血单个核细胞的培养，通过ELISA监测上清液中病毒特异性抗体的产生。抗体是由狂犬病免疫个体的淋巴细胞产生的，而非免疫个体的淋巴细胞在体外用DKCV刺激后始终未能产生抗狂犬病抗体。用DKCV刺激的淋巴细胞的抗狂犬病病毒抗体应答的产生显示为抗原依赖性以及抗原特异性的过程。在相对较低的抗原浓度（10-1～10-2μg／培养物）下，观察到最佳的抗原特异性应答。随着培养物中抗原浓度的增加（每次培养大于1 μg），抗狂犬病病毒反应受到抑制，刺激后产生的抗体能够中和狂犬病病毒。

EGERT等［30］于1989年报道了巴斯德固定狂犬病病毒株（巴黎巴斯德研究所，兔脑第2 061代）通过交替传代至原代狗肾细胞而适应，适应性强的狂犬病病毒命名为巴斯德·波茨坦（Pasteur Potsdam），未形成CPE，收获4次，滴度为5.5～7.0 logMICLD50／mL。该菌株可在BHK21／S13、CER和N2a神经母细胞瘤细胞中生长。在BHK21／S13细胞培养物中，病毒滴度为6.0～8.5 logMICLD50／mL。在SDS-PAGE中，其G蛋白迁移速度比ERA株快，灭活的抗原诱导小鼠产生干扰素，该毒株通过抗狂犬病免疫球蛋白鉴定。收获的病毒液显示出0.4 IU／mL的抗原值。在对小鼠、大鼠、叙利亚仓鼠和兔进行皮下和腹腔接种，对叙利亚仓鼠和大鼠进行即时接种后，该病毒无致病性。

4 原代地鼠肾细胞疫苗

1958和1963年，KISSLING等［31-32］最先研究原代地鼠肾细胞（PHKC）培养疫苗；以后，FENJE［33］用SAD株适应原代地鼠肾细胞制成灭活疫苗，1968年，由加拿大批准用于狂犬病的暴露前和加强免疫。

前苏联用Vnukovo-32株毒种在原代地鼠肾细胞培养制备疫苗。Vnukovo-32株的传代适应过程如下为：将SAD株（来源于1935年在Alabama一只狂犬病狗体分离的街毒）在小白鼠脑内和PHKC交替传35代；在PHKC 37℃连续传10代；在PHKC 32℃传33~178代，命名Vnukovo-32［34-36］。用第33～178代病毒制备主毒种和生产用毒种，感染细胞培养液的病毒滴度要求不低于104.5，病毒液经紫外光照射灭活后制成冻干疫苗。疫苗有2种类型：一种是未浓缩纯化的原制疫苗，一种是浓缩纯化的疫苗。前者NIH效力要求不低于0.5 IU／mL，后者不低于2.5IU／mL；前者接种量为每次3 mL，根据暴露程度多次注射，一般接种10~25针；后者接种量为每次1 mL，按WHO推荐的6针法注射。该疫苗在前苏联和东欧许多国家广泛应用。据调查，在对约6万名暴露后接种者的治疗中，有4 416名证实为疯动物所咬伤，对严重咬伤的2 856名合并注射抗狂犬病球蛋白，结果除2例免疫不全者发病外均未得病。疫苗的效果还可从390名免疫者的抗体检查结果得到证实，这些免疫者在开始疫苗接种后10 d内可检测到中和抗体，高峰在25~35 d，并至少能维持240~360 d。SELIMOV等［37］还报道对46名被确证为疯狼咬伤者用PHKCV合并注射抗狂犬病球蛋白治疗，观察1~5年，未发生狂犬病者。

目前，原代地鼠肾细胞培养的Vnukovo-32疫苗仍在俄罗斯使用［38，12］。

我国由卫生部武汉生物制品研究所牵头，长春生物制品研究所、兰州生物制品研究所和中国药品生物制品检定所等单位合作，于1965年开始用北京株狂犬病固定毒株，通过原代地鼠肾细胞适应传代，研制成功一种原代地鼠肾细胞培养灭活疫苗［39-41］。生产用毒种的传代适应培育分以下3个过程：①用北京株兔脑固定毒感染2~3周龄地鼠肾单层细胞，置36~37℃培养2周左右（期间换液1~2次），弃去上清液，将感染的单层地鼠肾细胞用胰酶消化制成细胞悬液，加适量正常新鲜制备的地鼠肾细胞悬液，混合后再培养2周。再按上述方法用胰酶消化，加入正常原代地鼠肾细胞继续培养（此法称混合培养法），如此培养连续传4代，病毒滴度达102~103。②将上述第4代病毒液直接种入5 d左右正常地鼠肾单层细胞，根据病毒繁殖高峰，取培养的病毒上清液，接种地鼠肾单层细胞，继续传代。病毒滴度在10代前一直较低，病毒繁殖高峰也长达20 d左右。至37~43代期间，病毒滴度才上升至104~104.5，繁殖高峰缩短为8~10 d。传至44代后，病毒滴度基本稳定在104.5左右，繁殖高峰也稳定在5~7 d。但继续传代至68代，病毒滴度未见上升，繁殖高峰也未见进一步缩短。在整个传代过程中均未发现细胞病变作用，将该株地鼠肾细胞适应株称为“a”株。③为进一步提高“a”株病毒滴度，将第55代“a”株病毒在豚鼠脑内和地鼠肾细胞交替传代，结果在交替传3代后，地鼠肾细胞培养液的病毒滴度提高至104.5~105.5或更高，将该株病毒称为“aG”株，用于地鼠肾细胞组织培养疫苗的生产。将豚鼠脑毒种用60%甘油缓冲盐水于-10℃以下保存，脑毒种的病毒滴度达108以上。“aG”株毒种的生物学特性和稳定性经与北京株固定毒比较，结果表明，“aG”株对小白鼠、豚鼠、家兔、狗、猴的外周神经致病性几乎完全丧失，中枢神经的致病性明显下降；毒种抗原性经与北京株的交叉保护力和交叉中和试验表明，两者的抗原性很相似，无明显差异。用于制备疫苗的毒种为经豚鼠脑内传代的毒种。

原代地鼠肾细胞培养灭活疫苗后经浓缩、纯化、去佐剂等一系列工艺改进和升级，目前仍在我国疫苗市场销售和使用，原代地鼠肾细胞生产的人用狂犬病疫苗从2015—2020年连续6年的批签发量分别为80万、80万、100万、120万、63万和105万人份［42］，为预防我国人狂犬病发挥了积极作用。

5 结语

原代细胞是分解后组织的活细胞，通常以贴壁生长的形式开始于体外细胞培养。如对于生产特定的生物制品是必要的，则需筛查所用动物的病原微生物，降低生物制品被污染的发生频率，一般使用SPF级别动物。

原代细胞其独有的优势为：①仅使用简单的培养基和牛血清即可实现工业化生产；②通常对多种病毒具有广泛的敏感性，适合多种生物制品的生产；③质量控制中不需考虑DNA残留和致瘤性的问题。但其不足也很明显：①感染源污染的风险比传代细胞系高；②不同来源动物培养物的质量和病毒敏感性是可变的；③虽然非人类灵长类动物的细胞培养在过去被广泛使用，但其在某些国家和地区已越来越难以获得，而且有时使用这些动物需证明是符合要求的；④原代细胞不能像传代细胞系那样进行广泛的测试［43-44］。

原代细胞在生物学，特别是病毒学的发展中发挥了重要作用。几十年来，不同来源的原代细胞一直被用于生产人用减毒和灭活疫苗。原代细胞具有对多种病毒广泛敏感且制备相对简单的优势，自20世纪50年代以来，一些原代细胞如猴肾细胞已被用于生产灭活和口服脊髓灰质炎疫苗，在控制脊髓灰质炎方面取得了重大成就。另外，麻疹、腮腺炎、风疹和狂犬病等疾病也是通过广泛使用原代细胞制备的疫苗而实现有效防控的，这些细胞包括鸡胚以及猴、狗、兔和仓鼠的肾脏等［43-44］。尤其是我国自主研发的乙脑减毒活疫苗［45］，采用原代地鼠肾细胞生产，已有10个国家通过为约3亿儿童接种乙脑疫苗控制了流行性乙型脑炎疫情，同时改进了疫情监测体系［46］。

虽然WHO对使用原代细胞生产生物制品持观望态度，但在某些国家和地区，原代细胞生产的疫苗类制品仍在市场流通，为人类疾病预防和控制发挥着积极的作用。