1-甲基-4-苯基-1，2，3，6 四氢吡啶诱导小鼠嗅觉障碍的实验研究

张 欣，王 伟，司伟岳，魏一冉，李 静，袁良杰

（1.山东第一医科大学/山东省医学科学院基础医学院，山东 泰安 271000；2.泰安市第一人民医院神经内科，山东 泰安 271000）

帕金森病（Parkinson's disease，PD）是一种以黑质多巴胺能神经元进行性减少为主要病理特征的中枢神经退行性疾病，其临床表现为静止震颤、肌强直、运动迟缓和步态不稳为主要特征的运动症状[1，2]。近年来，越来越多的研究报道PD 的临床表现除经典的运动症状之外，还表现为以嗅觉障碍、便秘、情绪异常和睡眠障碍为主的非运动症状，其中嗅觉障碍的发生率最高，达70%～90%[3，4]。目前嗅觉障碍的发病病因及病理机制比较复杂，如基因突变、α-突触核蛋白病变、神经递质异常、神经免疫系统紊乱、环境影响等因素[5]。1-甲基-4-苯基-1，2，3，6 四氢吡啶（l-methyl-4-phenyl-l,2,3,6-tetrahydropyridine，MPTP）为目前PD 研究中应用较多的实验神经毒素。大量研究发现[6-8]，MPTP 的制备的PD 慢性模型和亚急性模型能够诱导小鼠的嗅觉障碍。基于此，本研究采用小鼠腹腔注射MPTP 制备PD 急性模型，探讨MPTP 诱导对PD 小鼠嗅觉功能的影响，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 本实验使用SPF 级10 周左右雄性健康C57BL/6 小鼠，体重20～25 g，由安徽常州卡文斯实验动物有限公司提供。小鼠在温度18 ℃～22 ℃和12 h/12 h 昼夜循环光照条件下饲养。小鼠自购买后在本实验室适应性饲养1 周后进行PD 小鼠模型制备。整个实验流程完全遵循山东第一医科大学实验动物伦理学的规定[批号：SYXK（鲁）20190022]。

1.2 实验试剂及配置 MPTP 购自美国sigma 公司，使用0.9%无菌生理盐水溶解MPTP，配成10 mg/ml MPTP，每只小鼠15 mg/kg，给药方式采用腹腔注射。兔抗-COX-2 抗体和兔抗-iNOS 抗体购自abcam 公司。

1.3 方法 将小鼠随机分为对照组和MPTP 组，每组6 只，MPTP 组腹腔注射MPTP（15 mg/kg），每2 h 注射1 次，共4 次，同样方法给予对照组注射生理盐水，注射5 d 后进行行为学检测，嗅闻识别行为学实验结束后取双侧的小鼠嗅球，称重，并检测炎性因子COX-2 和iNOS 蛋白的变化。

1.3.1 嗅闻识别行为学实验 首先，将对照组和MPTP 组小鼠放在新垫料中饲养3 d。然后，于第4天将小鼠生活的笼子里另一半换上新垫料，另一半为小鼠生活的旧垫料。实验开始时，将小鼠放在新旧垫料之间，检测系统自动记录3 min 内小鼠在新旧垫料分别活动的时间。如小鼠不能辨别自己生活过的旧垫料的味道而是在新垫料区域停留的时间更长，表明小鼠出现了嗅觉功能障碍。

1.3.2 样本处理与Western Blot 实验 嗅闻识别实验结束后，将小鼠用8%的水合氯醛麻醉，然后用粗剪刀将小鼠断头剥去皮毛层，使用细剪刀将小鼠颅前部轻轻剪开，双侧嗅球充分暴露置于干冰，用弯镊小心分离出双侧嗅球置于已提前称重的EP 管中进行称重。在一侧嗅球的EP 管中加入蛋白裂解液（每1 mg 加入100 μl 的蛋白裂解液）。将小鼠样品置于冰上，进行电动匀浆，匀浆至组织完全裂解为止，然后静置40 min，4 ℃，12，000 r/min 离心20 min。小心吸取上清液置于新的EP 管中，每个样本吸取1 μl 蛋白样品用于浓度测定，将余下的蛋白样品加入5X 蛋白上样缓冲液，置于95 ℃金属浴加热器中孵育5 min，冰上静置10 min。每个样品取15 μg 上样并进行电泳分离出不同分子量蛋白。电泳结束后在将蛋白在300 mA、90 min 条件下转至PVDF 膜上。转膜结束后，将PVDF 膜浸润于5%的脱脂奶粉封闭90 min，4 ℃摇床一抗孵育24 h，然后将二抗孵育PVDF 膜，90 min，用发光液进行显影。利用ImageJ 软件读取COX-2，iNOS 与β-actin 蛋白条带的灰度值。

1.4 统计学方法 应用GraphPad Prism 5.0 统计软件进行数据分析，计量资料以（）表示，采用t检验，以P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MPTP 对小鼠双侧嗅球重量的影响 注射5 d后，两组左侧和右侧嗅球重量比较，差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。

表1 MPTP 处理小鼠对小鼠双侧嗅球重量的影响（，mg）

2.2 MPTP 对小鼠嗅觉识别功能的影响 对照组小鼠嗅闻旧垫料时间长于嗅闻新垫料时间，差异有统计学意义（P＜0.05）。MPTP 组小鼠嗅闻新旧垫料时间比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；MPTP 组嗅闻旧垫料时间短于对照组，嗅闻新垫料时间长于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表2。

表2 MPTP 处理小鼠后对嗅觉识别功能的影响（，s）

表2 MPTP 处理小鼠后对嗅觉识别功能的影响（，s）

2.3 MPTP 对小鼠嗅球炎性因子COX-2 和iNOS 蛋白表达的影响 注射5 d 后，MPTP 组嗅球COX-2、iNOS 蛋白表达高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表3。

表3 MPTP 对小鼠嗅球COX-2 和iNOS 蛋白表达的影响（）

表3 MPTP 对小鼠嗅球COX-2 和iNOS 蛋白表达的影响（）

3 讨论

嗅觉功能障碍是PD 最早的非运动特征之一，约在90%的早期PD 病例中存在，早于运动症状的出现数年[9]。诱发PD 患者嗅觉障碍的原因极其复杂，主要涉及到遗传因素、环境因素、重金属中毒和病毒感染等[10]。目前制备PD 模型研究最多外源性药物是1-甲基-4-苯基-1，2，3，6 四氢吡啶（l-methy-4-phenyl-l，2，3，6-tetrahydropyridine，MPTP）[11，12]。研究表明[13]，鼻内接触MPTP 能够有效的诱导PD 患者的嗅觉障碍，导致小鼠嗅觉丧失以及与帕金森病相似的连续认知和运动改变，但作用时间较短。采用MPTP 制备PD 模型包括急性PD 模型、亚急性和慢性PD 模型，研究表明[14]，MPTP 制备PD 慢性模型和亚急性模型均可诱发PD 的嗅觉功能障碍。本研究采用MPTP 腹腔注射制备小鼠PD 急性模型，结果发现在注射MPTP 第5 天小鼠出现嗅觉障碍，表明腹腔注射MPTP 制备小鼠PD 急性模型能够诱导PD 的前期非运动症状嗅觉功能障碍。

嗅觉功能障碍多表现为嗅觉减退及丧失，嗅觉损害具体表现为气味辨别、识别、察觉的全面受损，而且气味识别的损害比气味察觉的损害更早、更加严重[15]。研究表明[16，17]，其主要的发病机制可能与神经炎性、线粒体功能异常、氧化应激、泛素一蛋白酶体系统功能障碍、兴奋性氨基酸毒性作用及细胞凋亡等有关。本研究结果发现，对照组小鼠嗅闻旧垫料时间长于嗅闻新垫料时间，差异有统计学意义（P＜0.05）；MPTP 组小鼠嗅闻新旧垫料时间比较，差异无统计学意义（P＞0.05），提示腹腔注射MPTP 后小鼠不能分辨新旧垫料的气味，表明小鼠的嗅觉功能受到损伤，说明MPTP 制备的PD 急性小鼠模型能够诱导小鼠的嗅觉功能障碍。研究表明[18]，腹腔注射MPTP 5 d 后导致中脑多巴胺能神经元损伤，证实MPTP 能够激活小鼠中脑黑质区的星形胶质细胞，释放炎性因子COX-2 和iNOS 等促炎蛋白酶[19]。COX-2 是PGE2 的合成限速酶，PGE2 可以在胶质细胞中调控IL-6 等炎性因子的表达[20]。iNOS 为诱导性一氧化氮合酶，诱导NO 的释放，NO 是一种参与多种生理过程的分子信使，在脑出血，脑水肿及神经退行性疾病中加速神经元的损伤[21]。本实验结果显示，MPTP 组嗅球COX-2、iNOS 蛋白表达高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），提示腹腔注射MPTP 导致嗅球区炎性因子COX-2 和iNOS 蛋白表达升高，表明MPTP 导致小鼠嗅觉障碍可能与炎症反应有关。

综上所述，MPTP 制备PD 急性小鼠模型能够诱导小鼠的嗅觉功能障碍可能与胶质细胞的炎症反应有关。