microRNA-21在骨肉瘤中的研究进展

申 振，武壮壮，张 龙，吕 智

（山西医科大学第二临床医学院，山西 太原 030001）

骨肉瘤（osteosarcoma，OS）是第二常见的原发恶性骨肿瘤，约占原发恶性骨肿瘤的20%，是最常见的非血液来源的恶性骨骼系统肿瘤。OS可以于任何年龄段发病，但原发高度恶性OS多见于10岁～20岁的儿童和青少年。骨肉瘤可见于全身所有骨骼，多发于生长迅速的部位，如长骨的干骺端，主要是股骨远端（43%）、胫骨近端（23%）以及肱骨（10%）［1］。几乎所有高度恶性OS都主诉有进展性疼痛。OS早期表现为受侵犯部位的疼痛和肿胀；患者可以在睡眠中被突然的疼痛惊醒，然而，早期的疼痛症状可以通过保守治疗改善，导致病情的延误。大约有15%～20%的OS患者在初次就诊时即被检测到远处转移，超过85%的转移灶为肺部，第二多见的转移为远处骨转移［2］。随着诊治水平的提升，OS患者5年生存率提升60%～70%［3］，但是早期发生肺转移的患者，其5年生存率小于20%［4］。

microRNA（微小RNA，miRNA）是一类长度为19～24个核苷酸的内源性小分子RNA，可通过非完全配对的方式，靶向结合相关mRNA的3'非翻译区，引导沉默复合体的形成，阻碍靶基因mRNA的翻译，甚至将其降解，从而达到调控相关蛋白表达的作用。miRNA具有以下特点：（1）位于基因非编码区；（2）进化上高度保守；（3）可在翻译水平对基因表达进行调整；（4）参与多种生物过程，调控大量蛋白的表达［5］。因为microRNA通过非完全配对的方式调控靶基因的表达水平，所以一种microRNA能够同时调控若干种基因，一种基因也能够同时被多种基因所调控，使得microRNA在疾病中的作用错综复杂［6］。

microRNA-21是microRNA家 族 中 的 一 员，定位于染色体17q23.2 ，紧邻空泡膜蛋白1（VMP1）基因，能够和PTEN、TPM1、PDCD4等抑癌基因的3抑非编码区结合，从而调控肿瘤的发生发展［7］。microRNA-21的前 体Pre-miR-21被RNaseⅢ剪切为前导链miRNA-21-5p和随从链miRNA-21-3p。现有文献大多未标明所研究的microRNA-21为其前导链还是后随链，但microRNA-21多指miRNA-21-5p，miRNA-21-3p少有报道［8］。近期有大量研究报道microRNA-21在骨肉瘤中的作用，然而国内外缺乏与此相关的综述。本文回顾microRNA-21在OS中的作用，希望能对临床治疗OS提供新思路。

1 microRNA-21与骨肉瘤

miRNA-21是一种抑癌基因，在大多数肿瘤组织中或肿瘤患者血清中呈现高表达［9］。吴子晏等［10］推测miRNA-21在OS中也高表达，并经过试验验证了该假设，提出miRNA-21是一个在OS发生发展过程中起到重要作用的基因，高表达的miRNA-21能够负调控RECK的表达，促进OS的侵袭和转移，有望作为诊断和预测预后的指标。此后多人对miRNA-21在OS中的作用进行了探究，本文拟从OS细胞系的生物学功能以及骨肉瘤的临床诊治等方面对miRNA-21在OS中的作用做一综述。

1.1 microRNA-21与OS细胞的生物学功能

由于microRNA采取非完全配对的方式与目的基因相结合并调控其作用，所以一种基因可能被多种miRNA调控，反过来，一种miRNA也可能调控多种基因的表达。同样，microRNA-21也通过多种途径调控OS的生物学功能。已有研究表明，在乳腺癌中，microRNA-21能够通过下调原肌球蛋白1基因（TMP1）的表达水平，进而抑制肿瘤的生长［11］。在结直肠癌中，microRNA-21负表达调控细胞程序性死亡因子4（PDCD4），能够介导肿瘤细胞的侵袭和转移［12］。在肝细胞癌中，磷酸酶和张力蛋白同源缺失基因（PTEN）的表达受到microRNA-21的抑制，促进肝癌细胞的增殖、侵袭和转移［13］。在OS中，microRNA-21也通过多种途径调节OS细胞的生物学功能。

Lv等［14］通过分析基因图谱，提出PTEN可能是microRNA-21潜在的作用靶点，经蛋白印迹试验证实：相比空白对照组，在microRNA-21高表达组中PTEN表达受抑制，而microRNA-21低表达组PTEN表达量升高。同时，因为PTEN负表达调控PI3K/Akt通路，Lv等人进一步验证得出结论：在OS细胞系（MG63）中，高表达的microRNA-21通过PTEN/Akt途径促进肿瘤细胞的增殖和侵袭，抑制细胞的凋亡。

此外，另一项研究结果表明［15］，在OS细胞系（MG63、U2）中，低表达的microRNA-21能够抑制肿瘤细胞的增殖，而通过TGF-β1抑制试验可以解除这一抑制作用，说明microRNA-21能够通过TGF-β1途径调控OS细胞的功能。但是研究者没有找到microRNA-21和TGF-β1的结合序列，所以microRNA-21可能对于TGF-β1并无直接调节作用，寻找被microRNA-21作用的TGF-β1上游基因可作为今后研究的着手点。

Zhang等［16］的研究表明，microRNA-21-5p高表达能够抑制PDCD4的表达水平。PDCD4是一种抑癌基因，被抑制后OS细胞的增殖能力受到负调控。他们还发现，长链非编码RNA XIST能够竞争性地结合microRNA-21-5p来调节PDCD4的表达水平。这提示我们长链非编码RNA与microRNA的相互作用可能有很大的研究前景。

1.2 miRNA-21与OS的 诊 断

随着医学影像学及病理学等临床辅助科室的发展，诊断OS的技术日新月异，然而X线片仍然是最常用的检查手段。骨肉瘤患者病变骨常有特征性骨膜反应，以“Codman三角”的形式出现，或呈“日光放射”的现象。MRI可以分清楚肿瘤骨质和软组织的边界，也可以确定肿瘤与周围组织的解剖关系。全身核素骨扫描和胸部CT能够帮助寻找OS的 转 移 灶［17］。根 据WHO2013版OS病 理 学 分型，OS可以分为低级别中心型OS、经典型OS、毛细血管扩张型OS、小细胞OS、继发性OS、骨旁OS、骨膜OS以及高级别表面OS等类型［18］。最终确诊OS的病理学分型需要经过专业的病理学诊断。然而，上述诊断手段存在着自身的局限性，由于影像学结果和病理切片的判读是人进行的，在确诊过程中，易受到检查条件、医师专业水准及经验、病理取材等人为主观因素的影响，从而可能导致OS的诊断不准确和不及时；同时，临床最终确诊OS依赖穿刺或者切开取活检，这也可能会导致OS的进一步侵袭和转移，还可能导致病理性骨折的发生［19］。因此，探索一种新的客观且非创伤性的诊断指标可能能够帮助人们更早、更及时、更准确地诊断OS，同时减少不必要的并发症。

宋魏等［20］收集了120例手术切除的OS标本及患者外周血标本，所有OS标本均已被临床确诊。经过实时荧光定量PCR检测，OS患者外周血单个核细胞中microRNA-21的表达量显著高于正常对照组（P＜0.05 ），相对表达量2－△△Ct分别为1.43 表量于正（OS组）和0.67 表量于正（正常对照组）。Yuan等［21］通过对比分析不同OS患者外周血和正常对照组血清中microRNA-21的表达量后提出，microRNA-21表达水平在OS病人血清中较正常对照组升高。在分析血清microRNA-21表达水平与OS患者的各项指标的关系时，提出OSEnneking分期和其血清microRNA-21表达水平密切相关，且Enneking II期OS患者较Enneking I期患者血清microRNA-21表达水平明显升高（P＜0.001）；但研究并未发现血清microRNA-21表达水平与OS患者的年龄、性别、肿瘤部位及肿瘤亚型有关。

1.3 miRNA-21与OS的 治 疗。

最近研究表明，microRNA等非编码RNA在肿瘤发生发展中调控着一系列非常重要的基因和信号传导通路。在治疗OS时，基因和分子靶向治疗却未能广泛应用于临床，手术联合化疗仍然是临床治疗OS的主要方式［22］。近年随着新辅助化疗的出现，能够及早杀灭潜在的微小转移灶，缩小肿瘤体积，为手术创造有利条件，明显改善非转移性OS患者的预后。早期临床上采用多药联合化疗方案，包括多柔比星、顺铂、博来霉素、环磷酰胺或异环磷酰胺、放线菌素D和大剂量甲氨蝶呤中的至少三种组合［23］。近期临床试验证明，采用顺铂和表柔比星两种化疗药物的短期密集化化疗方案与多药联合方案疗效无明显差异［24］。顺铂作为一种常用的化疗药物，被普遍应用于OS的临床治疗。然而，在临床治疗的过程中，化疗药物耐药性一直是影响化疗效果的一大障碍［25］。

Ziyan等［26］提 到，在 人OS细 胞 系（MG63）中，microRNA-21能够调控OS细胞对顺铂化疗的敏感性。高水平表达的microRNA-21提高OS细胞对顺铂的耐药性，敲低OS细胞microRNA-21的表达水平，可以间接抑制bcl-2蛋白的表达水平，从而增加OS细胞对顺铂化疗的敏感性。

然 而Vanas等［27］的 研 究 表 明，在OS细 胞 系（MG63）中，通过质粒构建microRNA-21异位高表达模型，能够提高细胞对顺铂的化疗敏感性。该结论与Ziyan等［26］的结论完全相反，Vanas等［27］推测，这可能是因为Ziyan等［26］通过慢病毒转染microRNA-21寡核苷酸到OS细胞时，同时抑制了miRNA-21-3p的表达水平。在一项研究中，Pink等［28］在探究miRNA-21-3p表达水平与肿瘤化疗敏感性的关系时发现：在卵巢癌中，miRNA-21-3p和miRNA-21-5p的作用完全相反，抑制miRNA-21-3p的表达水平可以提高细胞对顺铂化疗的敏感性；抑制miRNA-21-5p则降低细胞对顺铂化疗的敏感性。

在Yuan等［21］的一项临床研究中，根据化疗后病理学检查结果，将65名OS患者分为化疗有效（35例）和无效组（30例），两组患者血清microRNA-21表达水平分别为6.19 ±0.80 和3.92 ±0.33 （ΔCt值，P＜0.001），说明血清microRNA-21高表达的OS患者对化疗具有抵抗性，往往预示着不良的临床预后。

2 展望

microRNA种类繁多，据报道已有上千种microRNA在人体内被发现。其作用机制纷繁复杂。一种microRNA可能通过多种机制调节机体功能，一种作用机制也可能受到多种microRNA的调节。研究表明，作为一种癌基因，miRNA-21在多种肿瘤组织中表达量升高，OS也不例外，在OS中发挥重要的生理功能，能够促进OS细胞的增殖、侵袭和转移，抑制细胞凋亡，增加细胞对化疗药物的抗性［29］。

作为一种稳定高表达的癌基因，microRNA-21在OS的诊断、治疗和分析预后中有着十分广阔的应用前景，有望为临床治疗OS提供新的靶点和思路。既往研究表明，患者ALP、LDH水平的升高成为预测OS预后的因素［30］。恶性肿瘤在诊断时最重要的预后因素是肿瘤分期和分级，Yuan等的研究成果将microRNA-21的表达水平和OS的Enneking分期联系起来，有助于预测预后，帮助作出临床决策［21］。

另外，在OS领域中，目前研究主要侧重于探究miRNA-21的前导链miRNA-21-5p的作用，而其随从链miRNA-21-3p的作用少有报道。探究miRNA-21-3p在OS中的作用，或是比较上述二者在OS中发挥的作用有何异同，可以作为今后研究的方向。

本文局限性在于尚未有足够多的文献支持，关于microRNA-21在OS中的生物学作用，未能全面而深入地进行阐释。再者，尽管大量体内外的试验表明，通过microRNA-21抑制剂或者锁核酸能够阻断或者调低胞内的microRNA-21表达水平，成为潜在的临床治疗OS的手段，但是目前仍然缺乏相关的临床试验来证实这一点。