干细胞疗法在血友病性关节炎治疗中的应用进展

沈绍宁，吴东晓，吕帅洁，肖鲁伟，童培建

(1.浙江中医药大学第一临床医学院，浙江 杭州 310053；2.浙江省中医院，浙江 杭州 310006)

血友病是一种X染色体连锁的隐性遗传性出血性疾病，可分为血友病A和血友病B，前者为凝血因子Ⅷ缺乏、后者为凝血因子Ⅸ缺乏，均由相应的凝血因子基因突变引起[1]。该病的主要临床表现为出血。血友病性关节炎(hemophilic arthritis，HA)是由血友病患者(people with hemophilia，PWH)关节腔内反复出血而引起的关节退行性变和滑膜炎症，是血友病主要的并发症之一，严重影响PWH的生活质量。目前，临床上治疗HA的方法主要为预防出血和骨科手术。凝血因子替代治疗是目前预防血友病出血的主要方法[2]，然而替代治疗价格昂贵，在发展中国家的应用受到限制；该疗法主要对尚未发生关节炎的儿童PWH具有预防作用，而对已经发生关节炎的PWH，提高凝血因子水平难以延缓病情进展，需采用骨科手术治疗[3]。目前，亟需寻求一种新的有效方法来延缓HA病情进展。干细胞是具有多向分化潜能的细胞，在再生医学领域备受关注。近年来，有关干细胞疗法治疗HA的研究[4-6]取得了显著成果，并已证明此疗法可以修复骨与软骨缺损，延缓HA病情进展。本文就干细胞疗法在HA治疗中的应用进展综述如下。

1 治疗HA的干细胞类型

目前，用于治疗HA的干细胞类型主要包括造血干细胞(hemopoietic stem cell，HSC)与间充质干细胞(mesenchymal stem cell，MSC)。HSC是血液系统中具有长期自我更新能力和分化成各类成熟血细胞潜能的成体干细胞。HSC作为基因载体细胞，可以用于HA的基因治疗。MSC是源于中胚层的具有自我更新和分化潜能的多能祖细胞，其来源丰富，可从骨髓、脂肪、脐带、软骨等中分离获取。MSC关节腔内移植法在骨关节炎等疾病的治疗中已被证明具有修复软骨和延缓病情进展的作用，但目前临床上尚无MSC关节腔移植治疗HA的报道。有研究[4，7]表明，MSC关节腔移植能有效减少关节腔内出血、促进骨与软骨修复、延缓关节炎病情进展，可成为治疗HA的有效方法。

2 基于HSC的基因治疗

2.1 基于HSC的基因治疗的优势将能正常表达凝血因子基因的病毒载体在体外转导至靶细胞，再输入患者体内的方法，称之为间接基因治疗法。随着研究的不断深入，许多体细胞被用于HA的基因治疗，如成纤维细胞、血管内皮细胞、肝细胞等，但仍存在细胞活力丧失、难以持续表达等问题[8]。基于HSC的靶向血小板表达凝血因子Ⅷ的基因治疗是目前最具潜力的治疗策略[9]。将能正常表达凝血因子Ⅷ的基因通过慢病毒载体或CRISPR/Cas9、TALEN等基因编辑工程技术[10]转导至HSC，在体外富集增殖后，再将其注入患者体内，HSC将分化形成包含血小板在内的血细胞，在巨核细胞和血小板特异的启动子控制下，凝血因子Ⅷ特异性表达并储存于血小板中，从而实现治愈HA的目的。基于HSC的基因治疗相较于直接输注病毒载体及其他体细胞基因治疗具有以下优势：①凝血因子替代治疗与一般基因治疗的凝血因子均表达于血浆中，因此对于临床上存在中和抗体的患者，这2项治疗均不能取得良好的效果；而基于HSC的基因治疗，在巨核细胞和血小板特异性启动子(包括GPαIIb启动子、GPαIb启动子、血小板因子4启动子)的控制下，凝血因子Ⅷ特异性表达并储存于血小板α颗粒中，减少了其在血液循环中的暴露时间，避免受到中和抗体的抑制作用，对于存在中和抗体的患者同样有效。②血小板可在表达凝血因子Ⅷ的同时表达血管性血友病因子(von willebrand factor，VWF)，二者结合形成VWF和凝血因子Ⅷ复合物，并与血管内皮胶原进一步结合，提高血栓稳定性。③HSC持续表达凝血因子Ⅷ的能力更强。王大威[11]通过小鼠实验发现，往小鼠体内注射的HSC可参与造血系统的发育，持续表达凝血因子Ⅷ，甚至在二次移植后仍能保持这一能力。

2.2 基于HSC的基因治疗的安全性基于HSC的基因治疗的安全性是目前的热点问题。首先，体外基因编辑及细胞培养增殖过程中由于基因突变及拷贝数变异等问题[12]，存在发生基因组改变的风险，且在后续治疗中存在致癌的危险。尽管许多动物实验未发现通过HSC基因治疗后存在致癌现象，但这一问题仍应引起重视。其次，以胚胎干细胞或诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cell，iPSC)为来源诱导分化为HSC的过程中，因在体外难以模拟生理状况下HSC分化的微环境[13]，所以很难实现HSC准确定向分化。王大威[11]通过iPSC体内分化畸胎瘤细胞的方法分化形成以髓系及淋系终末造血细胞为终点的HSC。但由于体内分化存在不可控性以及畸胎瘤本身的类癌风险性，靶向血小板的基因治疗在临床上应用面临巨大挑战。对于老年PWH，在动脉粥样硬化等风险增大的前提下，靶向血小板表达凝血因子Ⅷ的基因治疗是否会增加老年PWH血栓形成风险仍不明确[14]。为了评估靶向血小板的基因治疗的安全性，Baumgartner等[15]建立了高于凝血因子最低治疗量30倍的转基因小鼠模型，并评估了与血栓形成相关的各项参数，结果显示血小板高浓度表达凝血因子Ⅷ增加转基因小鼠血栓形成的风险。今后仍需更多的动物实验及临床研究来进一步验证基于HSC的基因治疗的安全性。

2.3 基于HSC的基因治疗存在的问题血友病作为单基因缺陷疾病是基因治疗的首选疾病之一。Nathwani等[16]通过对血友病B患者静脉注射能够表达凝血因子Ⅸ的腺相关病毒载体8(adeno associated virus，AAV8)，成功地进行了血友病B基因治疗的Ⅰ期临床试验研究。但是，通过直接注射病毒载体的方式仍存在许多问题。首先，AAV8病毒载体表达的凝血因子于血液循环中，若PWH存在中和抗体，难以避免受到中和抗体的抑制作用[17]。其次，大部分PWH因长期输血或使用血液制品，存在感染肝炎病毒或HIV病毒的风险，易导致基因治疗失败。此外，在凝血因子Ⅷ或Ⅸ基因成功导入肝细胞后常伴随谷氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase，ALT)升高随即凝血因子表达下降的情况，难以实现基因持续表达[16]。以往由于凝血因子Ⅷ基因过于庞大(编码区长度约为7.0 kb，超过了插入AAV的允许范围)，且全长凝血因子Ⅷ蛋白的细胞表达率较差等原因，血友病A的基因治疗被认为比血友病B更具挑战性。Valoctocogene roxaparvovec疗法又名BMN270疗法，是一种使用AAV5病毒载体递送表达凝血因子Ⅷ基因的创新基因疗法，该疗法的出现给血友病A患者带来新希望。BMN270是一种无复制能力的AAV5基因载体，包括位于其5'和3'末端的双链反向末端重复序列，以及编码杂合人类肝脏特异性启动子的单链DNA、B结构域缺失的人凝血因子Ⅷ cDNA和合成型聚腺苷酸化信号[18-19]。ALT升高是BMN270基因疗法最常见的不良反应，需使用激素加以控制。此外，BMN270基因疗法对于存在凝血因子Ⅷ抑制物病史患者的疗效仍不确切。目前，BMN270基因疗法的基础研究仍存在较多局限性，需要更多的临床研究以验证其长期疗效及安全性[20]。

3 基于MSC的细胞治疗

对于已发生关节病变的PWH，虽然基因治疗可以提高患者凝血因子水平，避免自发性出血，但是难以遏制关节病变的进展[21]。鉴于此，Kashiwakura等[22]提出了基于MSC的细胞治疗。基于MSC的细胞治疗已经在骨关节炎的治疗中取得了显著成效[23]。HA与骨关节炎在病理机制上存在相似性，且大量动物实验研究[4，6，22]也证实了基于MSC的细胞治疗对HA有相当的疗效。

3.1 基于MSC的细胞治疗的作用机制与骨关节炎的细胞治疗不同，HA的细胞治疗需将表达正常凝血因子Ⅷ和Ⅸ基因的病毒载体转导至MSC，体外富集增殖后再输入患者关节腔内。从HA的发病机制出发，HA治疗的潜在目标包括含铁血黄素清除、炎症消除、血管重塑及骨与软骨修复[24]。基于MSC的细胞治疗机制与HA治疗的潜在目标有着较高的契合度，主要包括止血、免疫调节及骨与软骨修复。

3.1.1止血 HA发生发展的关键在于关节腔内反复出血，而出血产生的含铁血黄素将沉积于滑膜并引起炎症，Fe2+刺激滑膜薄层转化为肥大的绒毛膜。由于炎症与增生滑膜的需氧量增加，刺激血管内皮生长因子的表达，导致滑膜新生血管形成，而新生血管更容易受到损伤而引发出血。因此，出血-增生滑膜-新生血管这一恶性循环是加剧HA进展的主要原因。基于MSC的细胞治疗有望打破这一恶性循环，因为MSC在关节腔内呈高浓度，当出血发生时，高浓度的凝血因子被及时释放而用于止血，在血浆凝血因子Ⅷ水平未增加的情况下，基于MSC的细胞治疗仍能有效进行止血。与凝血因子替代治疗相比，MSC移植治疗的优势是持续地产生凝血因子而非突然地大量增加凝血因子，这也有利于避免凝血因子抗体的产生。

3.1.2免疫调节 免疫调节作用机制包括分泌免疫抑制性细胞因子配体和受体以及直接调节免疫细胞分化来调节免疫反应[25]。首先，炎症因子干扰素γ、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)α和白介素( interleukin，IL)1β等能刺激MSC表达免疫抑制剂、程序性细胞死亡配体1(programmed cell death Ligand 1，PD-L1)和PD-L2以及下调免疫球蛋白样转录物受体，从而抑制炎症反应[26]。其次，MSC还可通过其表达的免疫调节因子来调节多种类型的免疫细胞，从而达到抗炎的目的。MSC不仅抑制高度糖基化的Ⅰ型跨膜糖蛋白CD34和HSC的单核细胞分化[27]，还可以通过吲哚胺2,3-二加氧酶、CC基序配体18和前列腺素E2诱导巨噬细胞从促炎切换到抗炎[28]，表达高水平的免疫抑制因子(如IL-10)和低水平的免疫激活剂(如IL-6，IL-12，TNF-α ，IL-1β，IL-23，CD86)。活化的MSC分泌免疫抑制蛋白TNF-α刺激基因6(TNF-α stimulated gene 6，TSG-6)，并抑制新分化的巨噬细胞的活化。TSG-6与巨噬细胞上表达的CD44相互作用并减少核因子-κB的核易位[29]。此外，MSC可以根据微环境，释放抑制因子、刺激因子或表达其他表面分子，抑制B细胞、T细胞、NK细胞等活性，发挥其免疫调节功能，从而降低炎症反应。

3.1.3骨与软骨修复 MSC的分化作用与旁分泌作用是骨与软骨修复的主要作用机制。MSC微环境在其中起到了重要作用，主要指分子及细胞层面的基质细胞、微循环、信号转导通路等多方面多层次组成的MSC生存环境[30]。HA的病情进展与骨质疏松和骨质破坏有着密切关系，而MSC所具有的成骨、成软骨分化能力有助于骨质疏松和骨质破坏的改善。在MSC的成骨、成软骨分化过程中微环境起到了决定性作用。在MSC的成骨分化机制中，BMP信号通路、Wnt 信号通路、Notch 信号通路、整合素家族、非编码RNA 包括长链非编码RNA、微小 RNA和环状 RNA均起着重要作用[28]。此外，微环境产生的空间边界条件因素对成骨分化也具有重要作用。研究发现，在直径为100 μm和150 μm空间边界条件下培养的MSC具有更强的成骨分化能力[31]。MSC的成软骨分化，除受Wnt 信号通路、Notch 信号通路等调控外，还受到包括Sox家族的Sox9、T-box 转录因子家族的Brachyury、C-myc、ERG和Runx2等转录因子的调控。因此，对下游信号通路及转录因子的调控是促进MSC成骨、成软骨分化的关键。

既往学者们认为，MSC是通过分化骨细胞、软骨细胞进而替代原有损伤组织来修复骨与软骨缺损的。但是，近年来的研究发现，MSC是通过旁分泌作用特别是外泌体调节微环境来促进其自身修复的[32-33]，而非简单地进行新旧细胞的更替。外泌体通过对多条信号通路及细胞因子的调控(如蛋白激酶B、细胞外调节蛋白激酶、Wnt信号通路、微小RNA等)来抑制软骨细胞凋亡、促进损伤软骨细胞修复及促进软骨细胞增殖。

3.2 基于MSC的细胞治疗存在的问题理想的基于MSC的细胞治疗应为移植后的MSC能长期稳定地表达凝血因子，然而多项已经通过移植MSC治疗成功提高了凝血因子水平的动物实验均未能实现凝血因子的长期持续表达，其原因可能为细胞生存能力丧失或出现了抑制抗体[34]。由于很难实现凝血因子长期持续表达这一理想目标，HA患者可能需要定期地进行MSC移植治疗，这无疑是对关节的重复损伤，并且还增加了感染的风险。此外，Kashiwakura等[4]的研究结果表明，能表达凝血因子Ⅷ的MSC移植治疗会导致凝血因子Ⅷ抗体滴度升高，这意味着此项治疗可能会增加PWH凝血因子Ⅷ抗体滴度。今后仍需进行更多的动物实验及临床研究来进一步验证基于MSC的细胞治疗的安全性。

4 小 结

基于干细胞的基因治疗与细胞治疗为HA的治疗提供了新的思路。腺相关病毒载体(AAV5、AAV8)介导的基因治疗已经在临床上取得一定的成果，但存在受抑制物影响、ALT升高及凝血因子难以持续表达等问题。基于HSC的靶向血小板基因治疗有望突破这些局限，但仍难以逆转HA的进展。基于MSC的细胞治疗或将成为HA的主流治疗方法，因其可以有效止血并通过抑制炎症反应、促进骨与软骨修复等机制延缓甚至逆转HA的进展。目前，基于MSC的细胞治疗仍未应用于HA的临床治疗，因此其注射方式、剂量、优化疗效途径及安全性问题是今后亟需解决的问题。