蛋鸡脂肪肝出血综合征及其分子机制的研究进展

曾文惠，曾庆节，殷 超，杨小璇，王玉洁，茹 盟，刘佳婷，谢贤华，梁海平，魏 庆，黄建珍

(江西农业大学 动物科学技术学院，江西 南昌 330045)

蛋鸡脂肪肝出血综合征(fatty liver hemorrhage syndrome,FLHS)是影响全球养禽业的一种常见的营养代谢性疾病，由于能量摄入过高导致肝脏内脂肪过度沉积所引起。该病多发于产蛋高峰期的蛋鸡，笼养鸡是主要患病对象，发病后的鸡通常表现为体质量明显增加、产蛋量突然下降及突然死亡。病理剖检可见心、肝脏、肺脏等脏器表面有不同程度的脂肪沉积，肝脏肿大、发黄、表面有出血点，随病情加重甚至会引起肝脏破裂出血。近年来，随着社会的发展，集约化养殖的规模不断扩大，FLHS发病率也呈逐年上升趋势，正常情况下发病率一般为5%左右，严重时可高达30%，严重影响了蛋鸡的生产，给养禽业造成极其严重的经济损失。由于该病发病时难以觉察，常突然死亡，故实际生产中往往是预防大于治疗。现主要是从分子角度来分析FLHS的发病机理，旨在为FLHS的研究方向提供新的思路。

1 禽类脂质代谢的特点

体内存在的脂肪酸主要有3个来源：饮食摄入、脂肪组织生成和肝脏合成。大部分哺乳动物的脂肪酸都来自于脂肪组织的生成。而与哺乳动物不同，禽类脂质代谢的主要器官是肝脏，其中70%的脂肪酸都来自于肝脏合成，5%来自脂肪组织，剩余部分则通过采食获取[1]。禽类在摄食后，日粮中的脂类物质在胰脂酶的作用下形成乳糜微粒(CM)被肠上皮细胞吸收入血，随后低密度脂蛋白(LPL)作用于CM，使脂肪酸释放并被肝脏吸收，之后以复合物的形式由极低密度脂蛋白(VLDLs)将其运出肝脏，运至循环系统，最终，经LPL作用使血液中游离脂肪酸又进入脂肪组织重新合成脂肪。蛋鸡由于在产蛋阶段需要大量的脂质供应来形成蛋黄，因此蛋鸡FLHS的发病率往往高于肉鸡。

正常情况下，肝脏中的脂质代谢常处于一种动态平衡的状态，而FLHS发生的实质上就是这种平衡被打破，使得脂质的合成远大于其分解，或者脂质运输障碍，最终导致脂肪沉积于肝脏。因此一旦有关脂质合成、转运和β-氧化等过程中的任何一个环节发生障碍，都会有引发FLHS的风险。

2 FLHS的发病原因

关于FLHS产生的机理，一直以来学术界有多种讨论。其中最为流行的有“二次打击”学说和“多击”理论。最早DAY等[2]提出了“二次打击”学说，认为FLHS的产生需要2个条件：肝脏内的脂肪变性和脂质的氧化应激。该假说表示禽的脂代谢失衡与胰岛素的功能障碍有很大联系，禽类往往较哺乳动物更易于发生胰岛素抵抗，发生胰岛素抵抗后的禽体内脂肪分解加剧，使得体内游离脂肪酸含量随之上升，引起肝细胞的通透性和线粒体功能的改变，脂质的代谢失衡，导致过多脂肪蓄积于肝脏，大量脂肪在肝脏的长时间滞留而发生过氧化促使体内的活性氧/氮自由基等活性氧族含量增多，从而使机体内氧化/抗氧化系统失衡，自由基超量聚积并作用于肝脏，进一步损伤溶酶体、线粒体及肝脏细胞的结构完整性，破坏其生物膜，引发细胞的炎症坏死，最终导致FLHS。其中，胰岛素抵抗是FLHS产生的重要一环，目前被普遍认为主要受到营养和遗传因素的影响。

然而随着研究的深入，“二次打击”学说不再能充分解释患病动物体内发生分子及代谢变化。于是，在此基础上“多击”理论诞生了[3]。该理论认为除胰岛素抵抗和氧化应激外，营养、激素、环境、遗传、应激、基因及表观遗传调控、肠道微生物等多种因素均可诱发FLHS。然而，对于现代集约化生产，其中管理、环境等因素可以得到较好控制，因此，营养因素是当前养禽业中引起FLHS的主要原因。以下将对FLHS的几种影响因素进行归纳综述。

2.1 营养因素

2.1.1日粮 日粮中能量/蛋白比是引起FLHS的主要因素，当日粮中能量/蛋白配比不均衡时易引起FLHS。如高能低蛋白(high energy low protein，HELP)日粮，一方面由于高能日粮导致肝脏代谢负荷过大，无法代谢体内过多脂肪酸，从而引起肝脏内脂肪酸的堆积；另一方面，低蛋白致使机体内没有足够的原料合成载脂蛋白，使脂类无法从肝脏运出，肝脏内脂肪蓄积加重；而高蛋白低能日粮同样也会引起FLHS，低能日粮使机体加大对氨基酸的代谢，其代谢产物加重肝脏负担所致[4]。

2.1.2营养元素的缺乏 蛋氨酸与胆碱是体内磷脂酰胆碱的前体物质[5]，对于VLDL的合成是必不可少的。当日粮中缺乏这两种物质时，VLDL合成受阻，导致脂质蓄积于肝脏。甜菜碱、维生素B12/C/E等物质由于参与胆碱的合成，故这些物质的缺失也会造成肝脏脂肪沉积[6]。

2.1.3外源性药物和添加剂的使用 外源性药物和添加剂的使用在一定程度上也会影响FLHS的发展。比如四环素，它作为一种抑菌剂，其作用机理是通过抑制蛋白质的合成来阻碍细菌的生长繁殖，但这种特性也抑制了脂蛋白合成，阻碍了脂质从肝脏运出，造成脂肪在肝脏的大量堆积，故其滥用时易引发FLHS。而与此相反的是，二氢吡啶的添加则可引起血清中载脂蛋白的含量上升，促使脂质从肝脏运出，减轻肝脏负担[7]。

2.2 激素因素某些激素可调节脂质分解与合成，如甲状腺素、胰高血糖素、皮质醇等激素可促进脂肪分解，而胰岛素、雌激素等激素可推动脂质合成。其中蛋鸡高发FLHS的一个重要原因就是体内雌激素含量升高，一方面其刺激肝脏合成脂肪，一方面又可抑制肝脏中线粒体对脂质的氧化，从而导致肝脏内脂质含量急剧上升[8]。

2.3 环境因素饲养方式不合理易引发FLHS，比如鸡舍内密度过大，鸡群由于缺乏运动空间而导致能量消耗下降引起的脂肪沉积，这种情况常见于集约化养殖场。高温和应激也易导致FLHS，高温环境时由于需能少且此时甲状腺素受抑制从而利于脂质在体内的堆积。应激则主要是通过刺激糖皮质激素的产生，从而促进糖异生作用，推动脂质合成[9]。

2.4 遗传因素FLHS具有很强的遗传相关性，比如蛋用种鸡往往比肉用种鸡的发病率高，节粮小型蛋鸡比中型蛋鸡发病率高。即使是相同的环境与饲喂条件，不同品种或品系的鸡肝脏内的脂肪沉积程度也会不同。种系或是个体间遗传状态的不同，往往代表了其对FLHS易感程度的不同。

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2.5 其他因素误食重金属、毒物、霉变的饲粮时也会引起FLHS，汞、铅、砷等重金属通过抑制蛋白质合成从而促进FLHS的产生。毒物和霉变则主要通过损害肝脏而使其功能受损，致合成脂蛋白的能力下降，造成肝脏内脂质堆积。另外，有研究表明肠道的微生物菌群也与FLHS的产生有一定的联系，通过利用益生菌改善肠道环境可对该病起预防作用[10]。

3 FLHS形成的分子机制

FLHS形成的潜在分子机制有很多，大多相互交织，互为联系。如AMPK和JAK-STAT信号转导通路，以及表观遗传调控等都涉及其中。

3.1 AMPK信号转导通路AMPK(AMP-activated protein kinase,AMPK)，全称AMP激活的蛋白激酶，可整合来自全身各处的输入调节能量的消耗与产出，维持代谢平衡，被称之为“代谢的主开关”[11]。由于几乎参与了生物体所有生理代谢的过程，故通常认为FLHS的产生与AMPK信号通路有着密切联系。AMPK活性由AMP/ATP调控，并由其上游的AMPK激酶(AMPKK)激活，在禽类中主要由LKB1进行。PROSZKOWIEC等[12]研究表明，激活后的AMPK一般通过2种方式发挥作用。第1种是直接作用于代谢相关酶，通过调节酶活来控制代谢，如经典的AMPK-ACC通路。乙酰辅酶A羧化酶(acetyl-CoA carboxylase，ACC)被AMPK磷酸化并灭活后会抑制脂肪酸的合成,同时导致丙二酸单酰辅酶A水平下降从而缓解了它对肉碱棕榈酸转移酶-1(CPT-1)的抑制，促进脂肪酸在线粒体中的氧化[13]。另一种是利用一些重要的转录因子影响代谢相关基因的表达，如AMPK-PPARα/HNF4α/SERBP1α。其中PPARα可通过介导体内脂肪酸β-氧化相关酶的表达推动脂质分解[14-15]。LIU等[16]研究发现高脂饮食可显著下调AMPK的表达。DIHINGIA等[17]的研究表明通过高脂日粮饲喂的小鼠体内ACC蛋白含量显著上升，而当经过治疗后小鼠ACC水平下降，说明ACC或许参与脂质合成。而CHENG等[18]在研究高脂日粮诱导小鼠的非酒精性脂肪肝(NAFLD)时发现，薯蓣皂甙元可通过上调AMPK表达从而减弱ACC活性，以达到预防NAFLD目的。以上结果表明AMPK确实可通过体内的某些通路如AMPK-ACC来影响脂质代谢，但多是针对以小鼠建立的模型为主。最近GAO等[19]用HELP日粮成功诱导了海兰褐蛋鸡FLHS模型，并经研究指出FLHS蛋鸡AMPK的mRNA及CPT1的mRNA较对照组表达量下降，而ACC、FAS、HMGR、HNF4α的mRNA表达量上升，暗示AMPK主要通过影响脂质代谢中ACC、HMGR、FAS等相关酶的表达来影响脂质在肝脏中的沉积。另外，受AMPK-SERBP1a、1c直接调控的Cidea基因最近也被研究证实在脂质积累和诱导FLHS的过程中发挥重要作用[20-21]。近期，WANG等[22]在研究蛋鸡脂肪肝模型的时候发现了与自噬及凋亡有关基因的异常表达。此前也有研究证明肝脏的损伤与自噬基因的失活有关[23]，表明自噬可能参与对肝脏的保护。mTOR作为AMPK通路的下游底物可抑制自噬，以AMPK-mTOR作为切入点，通过调控mTOR的表达也许可以为FLHS防治提供理论支持。

3.2 JAK-STAT信号通路JAK-STAT信号通路由酪氨酸激酶JAK、酪氨酸激酶相关受体及转录激活因子STAT共3部分组成，通过JAK-STAT的作用介导体内某些细胞因子和生长因子(瘦素、IL-4、IL-6、IFN-γ等)的信号转导，参与细胞分化、增殖、凋亡、炎症、免疫调节等生理过程。目前JAK家族有4种：JAK1-3、TYK2；STAT家族有7种：STAT1-4、STAT5A/B、STAT6。其作用机制为细胞因子与受体结合使得JAK发生自体磷酸化，JAK的激活使受体中的酪氨酸残基也随之磷酸化，STAT被招募至受体表面激活并以二聚体的形式转移至核内调节相应靶基因的转录。该通路可受到SOCS、CIS、PTP等因子的影响。

STAT3作为JAK-STAT最重要的一员，常与体内的各细胞因子和生长因子共同参与对体内糖脂代谢的调节，此前大量的研究都证明了两者间的关系。瘦素是脂肪组织中分泌的一种肽类激素，通过介导JAK2-STAT3促进脂肪分解，抑制脂肪合成，维持肝脏内的能量平衡。朱梦梦等[24]的研究表明化积健脾汤可通过上调瘦素受体(LepRb)、JAK2、STAT3的表达，下调SOCS-3、IL-6，通过调节JAK-STAT通路，改善瘦素抵抗，减少脂质沉积。IL-6也是一种能量调节因子，IL-6/STAT3的组合被证实可改善体内的脂肪沉积，缓解肝脏的脂肪变性。研究表明，长期的IL-6治疗可通过激活STAT3上调Bcl-2、Bcl-xL等抗凋亡基因的表达，从而改善瘦素缺陷型的ob/ob小鼠及高脂饲喂、乙醇饲喂这3类小鼠脂肪变性程度，保护肝脏[25]。IL-6/STAT3还可通过影响胰岛素抵抗参与脂质代谢，但是积极还是消极影响目前仍有争议[26-27]。IL-22是一种抗炎因子，也是一种重要的护肝因子。YANG等[28]研究指出，IL-22通过激活JAK1-STAT3可下调TG合成有关基因的表达，减缓脂肪沉积。祝娟娟等[29]研究表明，NAFLD小鼠经蓝莓与益生菌处理后，可抑制炎性因子的同时上调IL-22的表达，通过激活STAT从而下调SREBP-1c的表达，达到TG和胆固醇合成下降，改善肝脏炎症及脂肪肝的目的。综上，JAK可通过与细胞因子的合作参与对肝脏中脂肪代谢的调节。近期，ZHU等[30]通过对构建的FLHS蛋鸡与健康对照组的基因表达图谱进行比较，筛选出多个差异表达基因，其中IL-6、SOCS-3和CNTF被认为可作为未来JAK-STAT中的潜在药物靶点，通过抑制IL-6、SOCS-3及促进CNTF的表达可增强胰岛素作用和葡萄糖稳态，缓解病症。

3.3 表观遗传修饰与FLHS表观遗传学是近年来发展迅速的新兴学科，它可在不影响基因序列的情况下通过DNA甲基化、组蛋白修饰、非编码RNA调控等表观修饰来双向改变基因表型。随着表观遗传学的发展，由此也为FLHS致病机制的研究提供了新的视角。

3.3.2组蛋白修饰与FLHS 除DNA甲基化外，组蛋白修饰也可以影响脂质的代谢。HU等[38]在往鸡蛋注射甜菜碱时发现新生仔鸡的肝脏内AHCYL1、DNMT1的含量和H3K27me3水平出现了明显波动，并伴随着胆固醇代谢相关酶HMGCR、CYP7A1、ABCA1等的异常表达，证实甜菜碱可通过表观遗传修饰介导新生仔鸡的胆固醇代谢。L-PK(L-型丙酮酸激酶)与NAFLD有着密切联系，对细胞增殖和糖脂代谢有积极的推动作用。而ZHANG等[39]用黄连素饲喂NAFLD小鼠时L-PK启动子的甲基化水平明显下降，并且伴随其周围H3、H4(H3K9、H3K18、H4K8、H4K12等)的乙酰化水平的显著上升，推动了L-PK的表达，加速了肝脏中糖脂类物质的分解。此前还有大量研究表明异常的组蛋白修饰与Ⅱ糖尿病等代谢性疾病密切相关，易导致胰岛素抵抗，进而引发NAFLD[40]。并且研究发现，NAFLD的产生往往与组蛋白的三甲基化修饰有着密切联系，高脂饲喂的小鼠体内H3K4me3、H3K9me3 水平的上升促进了PPARα及其网络周围基因的转录表达，进一步加剧了脂质堆积[41]。组蛋白修饰包括甲基化、乙酰化、泛素化等多种修饰，其中乙酰化修饰最为广泛，受到HAT与HDAC的共同调控。LEE等[42]在研究中发现HAT与HDAC的不平衡会引起肝脏中基因表型的异常而导致肝功能受损，进而导致NAFLD。此外，在组蛋白的众多修饰酶中研究较多的有P300(乙酰化酶)和SIRT1、SIRT3(去乙酰化酶)。P300主要介导与脂质合成、糖酵解有关的ChREBP的乙酰化，通过上调其转录活性，诱发NAFLD。SIRT1、SIRT3都是属于SIRTs家族的去乙酰基转移酶，SIRT1主要发挥抗炎、抗高脂血、增强胰岛素活性及调节葡萄糖稳态等作用。SIRT3则主要参与脂肪酸的氧化和维持线粒体的完整性。当对小鼠特异性的敲除SIRT1或SIRT3后，小鼠表现出了脂肪变性、胰岛素抵抗、高脂血症、NAFLD、脂肪性肝炎等一系列症状[43]。由此可见，通过对特定组蛋白修饰酶的抑制与激活或许可为预防NAFLD或FLHS提供方向。

3.3.3microRNA与FLHS 近期非编码小RNA调控也是研究FLHS的热点。microRNA 作为一种小的、非编码的RNA，主要通过阻止靶向mRNA 的翻译来调控基因表达，参与信号转导、细胞凋亡及对碳水化合物与脂类的代谢调节。此前有大量研究表明高脂饮食构建的NAFLD动物模型中出现了肝组织内miRs和靶基因的差异表达，如小鼠模型中miR-33a、miR-34a、miR-122等上调，miR-467b、miR-216、iR302a等下调的情况[44-49]。除此之外大量研究表明在NAFLD的发展过程中miR-122、miR-34a、miR-16及miR-21等在血浆中的水平也出现了明显改变[50-53]，这表明特定miRs的血浆水平或许可作为诊断NAFLD及其严重程度的重要指标。如丰度最高的miR122被认为是评估NASH患者发展成HCC风险的标志分子，也被认为是治疗高胆固醇血症及其他血脂异常的潜在治疗靶点[54]。miR-34a也是参与胆固醇及脂肪酸合成的重要miR，它可抑制SIRT1与PPAR表达激活，当其过表达时易引起脂肪的堆积变性，沉默时SIRT1、PPARa及其下游基因也相对的随之恢复激活。此前DERDAK等[55]研究发现P53可通过抑制miR-34a从而活化SIRT1/(PGC1a)/PPARa通路来改善NAFLD小鼠体内的肝损伤与脂肪变性。miRs在影响脂质代谢和炎症发展的过程中受到表观调控，SERNA等[56]研究结果表明编码H3K27的甲基转移酶-EZH2活性的缺失，可通过上调促炎性因子以及miR-200b和miR-155的表达推动脂肪堆积，促进NAFLD的发展。最近TAN等[57]研究筛选出了3个受DNA甲基化和IncRNA共同调控的靶基因(ABCD3、HAO1、BLMH)。目前miRs被认为是NAFLD潜在的生物标志物和治疗靶点，通过对这些代谢相关靶基因的深入研究或许可推动对FLHS分子机制的理解及保肝类药物的生产与发展，从而更好地防治FLHS的发生。

目前，有关表观遗传对FLHS调控的研究相对较少，其影响FLHS形成的机制还需进一步的研究。

4 诊断与防控

4.1 诊断

4.1.1临床症状 发病初期，患鸡无明显的临床症状，主要表现为过度肥胖、体质量异常，超出正常值的25%，且产蛋量在短时间内呈急剧下降，有些甚至出现产蛋停止现象。外表观之鸡冠和肉髯苍白、萎缩、腹部膨大下垂、触之柔软，可摸到厚实的脂肪组织。随着病情的发展，患病鸡出现精神沉郁、排稀粪、嗜睡、瘫痪等症状，并在明显症状出现后的1～2 d 内死亡。

4.1.2病理剖检 剖检后可见患死鸡心、肝、胃、肠等各器官表面有不同程度的脂肪沉积，腹腔含淡红色积液或血凝块。肝脏肿大、质脆、颜色发黄、表面伴随大小不一的出血点或坏死灶，切开后可见内部结构模糊，充满脂肪。

4.1.3实验室检查 取病死鸡的肝脏制成切片于显微镜下观察，可见细胞的胞浆内有数量不一的脂滴存在，不同脂滴融合将胞核压向一侧，呈现不同程度的脂肪变性现象。严重时，细胞间的界限消失，使得肝索与肝窦的结构难以区分。随之肝细胞会发生坏死，周围并伴随大量单核细胞浸润，其间质内充满脂肪。

4.1.4早期诊断 由于该病的病情发展迅速，患病鸡常在工作人员尚未觉察的情况下便突然死亡，故以上方法均算不上最佳诊断方案。出于对经济效益的考量，目前通常采取早期诊断的方式来避免FLHS的发生。通过监测蛋鸡体内特定物质的血液生化指标，可为早期诊断提供依据。刘鑫等[58]的研究结果表明，病鸡体内总伴随着Che、HDL-Ch等物质含量的上升及LDL-Ch、T-Ch等含量的下降，当其中Che占血浆总胆固醇含量的百分比低于60%时可将其作为FLHS发病诊断的早期指标。而HDL-Ch与LDL-Ch的比值低于50%时也预示着有患发FLHS的可能。此外，ALT与AST的升高则通常作为肝损伤的重要指标。

4.2 防控措施

4.2.1药物治疗 对于病情较轻的FLHS患病鸡可采用按每千克饲料中添加1 g氯化胆碱、900 mg肌醇、10 000 IU的VE及12 mg VB12的剂量服用3～4 周来缓解。由于该方法耗时较长，故也可对患病鸡连续10 d单纯性投喂0.1～0.2 mg氯化胆碱来治疗。对于病情严重的，按严重程度在上述方法的基础上多增加几个疗程。

4.2.2适时调整饲粮 尽量给蛋鸡饲喂营养丰富的全价粮，保证营养均衡，满足产蛋需求，注意饲粮中的能量水平。由于产蛋期的能量需求高，故在不同的产蛋阶段需对饲粮的蛋白能量比作出相应调整。当能量过高时，可将饲粮中的玉米用麸皮、大麦等替代。合理的使用添加剂VE、Se、黄酮类化合物及白芍、柴胡、龙胆草、山楂等中药药材也可在一定程度上预防脂肪肝的发生。除了调节饲粮营养，对于鸡群中的某些肥胖个体也可通过采取限饲的措施来减少蛋鸡脂肪肝的发病率。

4.2.3加强日常管理 保证鸡舍内的环境安宁和清洁卫生，定期进行消毒及维持通风良好，避免有毒气体在舍内蓄积。尽量把握好饲养密度，保证每只鸡都有足够的运动空间。当处于夏季高温时注意给舍内进行降温处理，减少热应激的发生。同时，在选种时也尽量避免选择易感品种，定期检查鸡群，对于超出正常体质量的15%～20%的鸡只进行淘汰处理，还要注意时常检查饲粮，以免鸡群误食霉变带毒的饲料，增加患上FLHS的风险。

5 结语

只有深入了解FLHS形成的分子机制才能从根本上预防该病的发生，然而目前，有关FLHS致病机制的研究还不是很全面。针对脂肪肝的分子层面的研究也大多集中在以小鼠为模型的NAFLD上，对FLHS分子机制的研究依旧乏善可陈。尽管FLHS与人类的NAFLD的发病机制存在许多相似之处，然而大多数研究中揭示的结论由于样本量小，缺乏在相应蛋鸡FLHS模型中进行大量验证而未能有统一定论。故未来应进一步大力开展相关生物学功能研究，揭示FLHS形成的分子机制，找出其作用的关键信号通路及其目标位点，通过筛选出诊断相关分子标记物和关键靶基因等来为促进FLHS的预防和治疗，推动保肝类药物的研发生产提供理论支撑。