猪圆环病毒2型感染及复制影响因素

方满新

(宜春学院 生命科学与资源环境学院，江西 宜春 336000)

猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2，PCV2)是一种流行于世界各地并严重影响养猪业的DNA病毒。目前已知3种PCV基因型，包括PCV1、PCV2和PCV3。PCV1于1974年首次被发现，为猪肾细胞PK-15的非细胞病变污染物，对猪无致病性；PCV3是一种与猪皮炎肾病综合征(PDNS)、生殖衰竭和全身炎症有关的新型圆环病毒，近年在美国、意大利、中国和波兰等多个国家被报道；PCV2是一种无包膜、单链、封闭的环状DNA病毒，属于圆环病毒科圆环病毒属，含有1 767或1 768个核苷酸，最早被发现于20世纪90年代，与猪的一系列综合征即猪圆环病毒相关疾病(porcine circovirus associated disease，PCVAD)有关，对养猪业造成了重大经济损失。虽然PCV2感染发病的机制研究已经取得很大进展，但仍有许多重要的问题尚未解决；预防和控制PCVAD的常见措施包括改进管理、控制合并感染、疫苗接种等，但迄今临床上缺乏有效的抗病毒治疗措施来控制PCV2感染。越来越多的研究表明，多种不同的宿主因素、外源因素及病毒自身因素影响PCV2感染与复制，本研究在总结分析各种研究的基础上，对近年PCV2感染复制过程中各类影响因素最新研究进展进行综述，为今后的相关研究提供参考。

1 PCV2结构特征及其感染与复制

PCV2拥有一个单链和封闭的环状DNA基因组，虽然PCV2基因组中有11个开放阅读框，但只有4个蛋白在感染过程中起重要作用。ORF1和ORF2是PCV基因组中最大的2个基因，分别编码复制酶(Rep)和衣壳蛋白(Cap)。Rep和Cap基因方向相反，在ORF1和ORF2的2个阅读框之间有1个基因间区作为病毒复制起点(origin of replication,Ori)启动病毒DNA复制，其特征是包含1个茎环结构。ORF3和ORF4编码非结构蛋白，ORF5最近被发现，其在PCV2感染后发病机制中的作用还未明确。基于ORF2序列分析，PCV2主要分为5个亚型，即PCV2a、 PCV2b、PCV2c、PCV2d和PCV2e，近年国内报道了一种新的与其他5种基因型具有较低序列同源性的PCV2基因型，并将其命名为PCV2f[1]。

PCV2病毒感染可分为附着、进入、脱包衣、基因组复制和表达、组装和释放等几个阶段。病毒吸附并穿透细胞膜，在胞浆中脱壳后病毒基因组进入细胞核进行转录、剪接、翻译，通过自我组装形成病毒样颗粒并进入衣壳，随后病毒颗粒穿透细胞核与细胞膜并最终释放。PCV2基因组通过滚环(RCR)机制进行复制，同时由于PCV2基因组较小(1.7 kb)，编码能力有限，其复制很大程度上依赖于宿主细胞因子。

2 PCV2感染复制中涉及的宿主因素

PCV2在感染后其复制严格依赖宿主细胞生理过程，宿主因子受到广泛调控，通过对PCV2复制机制相关研究分析，发现参与PCV2感染复制的宿主因子包括不同的宿主蛋白、MicroRNAs(miRNAs)等多种宿主因子。

2.1 促进病毒复制的宿主因素自噬是细胞维持稳态的一种重要机制，通过自噬可清除细胞内错误折叠或聚集的蛋白质以及受损老化的细胞器。自噬在某些疾病的发生和发展中起着重要作用。miRNAs作为内源性非编码RNA可以调节基因表达。大量研究表明自噬和miRNAs在调节病毒与宿主的相互作用过程中起着关键作用并影响病毒复制。WANG等[2]研究自噬、miRNA与PCV2感染之间关系并发现在3D4/21细胞中，PCV2感染与自噬呈正相关，PCV2感染诱导的自噬促进PCV2复制。同时对筛选出的4个miRNA进一步研究发现，miR-30a-5p模拟物对PCV2复制有显著影响，miR-30a-5p过表达以剂量依赖的方式显著增强PCV2感染和自噬，阻断miR-30a-5p显著降低PCV2复制。此外miR-30a-5p靶向并调控14-3-3基因，该基因是自噬调节因子，miR-30a-5p通过直接与14-3-3相互作用促进G2期细胞周期阻滞，从而调节PCV2的复制和自噬。另外通过高通量测序获得PCV2感染3D4/21细胞的miRNAs 表达谱并探讨miRNA-98在PCV2复制中的作用，发现miRNA-98可通过调节免疫相关细胞因子的表达来调控宿主免疫功能，协助PCV2逃逸宿主免疫，促进PCV2在3D4/21细胞中复制[3]。Hsp40/DnaJ家族蛋白在病毒感染过程中起着重要作用。猪DNAJB6(pDNAJB6)是该家族的主要成员，pDNAJB6在PCV2感染后显著上调，证实其与PCV2衣壳蛋白(Cap)相互作用并在PCV2感染细胞的胞浆和细胞核中共定位。进一步研究显示pDNAJB6在PCV2感染期间通过与病毒衣壳蛋白相互作用促进自噬的形成，从而促进病毒复制[4]。

另一方面，先天性免疫反应主要包括促炎细胞因子、干扰素和趋化因子的产生，干扰素是宿主天然免疫的重要组成部分。先前研究发现PCV2通过RIG-1和MDA-5信号通路诱导干扰素β(IFN-β)的产生进而促进病毒复制[5]。环鸟腺苷酸合成酶(cGAS)被认为是识别胞浆DNA的最重要受体。HUANG等[6]对PCV2诱导IFN-β产生是否与cGAS有关进行研究发现，PCV2感染可增加cGAS和接头蛋白干扰素刺激因子(STING)的表达水平，促进环二核苷酸(cGAMP)释放并诱导STING二聚体易位进入PK-15细胞核，表明PCV2感染可激活cGAS/STING信号通路诱导IFN-β的产生并促进病毒复制。另外白细胞介素(IL-10)作为一种重要的抗炎细胞因子，在PCV2感染过程中表达增加，利用IL-10敲除小鼠模型进一步探讨IL-10在PCV2感染中的作用机制，显示IL-10促进PCV2持续感染，PCV2感染可通过IL-10阻断T细胞向小鼠肺的转移，减少促炎细胞因子和PCV2特异性抗体的产生，并通过抑制T细胞浸润加重组织损伤[7]。

此外，宿主细胞的一些蛋白及酶类被发现参与PCV2感染及复制。高迁移率族蛋白1(HMGB1)是细胞核中一类主要的非组蛋白性核蛋白，负调控PCV2复制[8]。另一方面，研究发现PCV2感染可诱导HMGB1从细胞核向细胞质转位，而PCV2感染诱导的活性氧(ROS)升高与核HMGB1胞浆转位密切相关，丙酮酸乙酯能抑制HMGB1的核质转位，在丙酮酸乙酯处理PCV2感染细胞后，PCV2诱导的ROS生成降低，核质HMGB1易位受到抑制，PCV2复制也随之降低，即PCV2通过诱导ROS触发病毒DNA结合蛋白HMGB1的核质易位，进而促进其复制。研究发现PCV2核衣壳蛋白(capsid)氨基酸序列的Loop CT末端含有严格保守的 PXXP 功能性基序，该基序可能与含有Src同源性3结构域(src homology 3 domain,SH3)或Src同源性2结构域(src homology 3 domain,SH2)的酪氨酸激酶相互作用。ZHANG等[9]研究PCV2与酪氨酸激酶关系时发现，感染PCV2 增加Src家族激酶表达，PCV2在PK15细胞中的增殖依赖Src家族激酶，且Src家族激酶与血小板源性生长因子受体(PDGFR)协同作用于 PCV2 增殖。

有研究显示SYNGR2基因在促进病毒复制中发挥作用[10]，稳定干扰IFITM1表达细胞系的建立，表明干扰IFITM1基因明显促进PCV2复制[11]；RIG-Ⅰ信号通路促进PCV2在PK-15细胞中复制[12]；猪源转录因子AP-2δ(poTFAP2δ)可以特异性地增强Rep基因启动子活性，而且在PCV2感染过程中促进Rep和Cap基因转录、翻译及增加PCV2病毒滴度[13]等。

2.2 限制病毒复制的宿主因素蛋白激酶C(PKC)是一类使底物蛋白分子内丝氨酸/苏氨酸残基发生磷酸化的蛋白激酶家族，参与多种病毒感染、细胞抗病毒反应。3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶(HMGCR)是胆固醇生物合成的限速酶并参与多种病毒感染过程。MA等[14]发现PKC和HMGCR参与PCV2感染的不同阶段，HMGCR在感染的早期发挥抑制PCV2感染作用，而PKC在感染后期促进PCV2感染，此外PKC通过激活JNK1/2，调节这两种蛋白的磷酸化使HMGCR失活来增强PCV2复制，而HMGCR则可以抑制JNK1/2的磷酸化。研究发现HMGCR与PCV2感染在体内外呈负相关。TING等[15]进一步研究5′-一磷酸腺苷激活的蛋白激酶(AMPK)和蛋白磷酸酶2(PP2A)参与HMGCR介导的PCV2感染抑制以及猪HMGCR与PCV2蛋白的互作情况，发现细胞内AMPK活性在PCV2感染早期有波动，PP2A对PCV2感染和HMGCR活性影响不大，此外PCV2感染可通过直接与PK-15细胞中的蛋白互作来增强或维持HMGCR磷酸化水平。

另一方面，PCV2基因组ORF5编码一种非结构蛋白，先前研究表明ORF5蛋白抑制细胞增殖并与宿主跨膜糖蛋白NMB(GPNMB)相互作用。GUO等[16]对GPNMB是否影响PCV2的复制及其分子机制进行研究，首先对PCV2感染和转染ORF5的猪肺泡巨噬细胞3D4/2(PAM)的转录组图谱进行分析发现，PAMs中GPNMB基因表达下调并证明PCV2 ORF蛋白与GPNMB相互作用，此外发现细胞GPNMB显著抑制PCV2复制和ORF5表达[17]。PCV2衣壳蛋白(Cap)是一种独特的结构蛋白，在病毒复制和致病过程中起着关键作用，猪源MKRN1(pMKRN1)被发现与PCV2 Cap相互作用，PCV2下调pMKRN1以避免pMKRN1诱导Cap蛋白泛素化和降解，从而促进病毒在其靶组织中的复制。

其他研究包括波形蛋白参与PCV2复制并对PCV2复制有一定的限制作用[18]；ssc-miR-122可抑制PCV2的蛋白表达和病毒DNA复制，并通过与PK15细胞的3′非翻译区(3′UTR)结合而下调活化T细胞5核因子(NFAT5)和氨肽酶嘌呤霉素敏感区(NPEPPS)的表达[19]；核小体组装蛋白 1-like-4(NAP1L4)通过IFN-β信号途径抑制PCV2复制[20]；过表达猪SERPINC1基因能显著抑制猪肺泡巨噬细胞(PAM)中PCV2的复制[21]等。

这些研究从病毒利用宿主因子的角度阐释了 PCV2 利用宿主蛋白促进自身增殖的分子机制，为深入了解PCV2感染的发病机制以及PCV2感染过程中与宿主因子之间的相互作用提供新的见解，为PCV2感染的抗病毒治疗提供新的靶点及策略。

3 影响PCV2复制的外源性因素

3.1 促进病毒复制的外源性因素谷氨酰胺(glutamine，Gln)是体细胞内外丰富的游离氨基酸，在蛋白质和能量代谢中起着核心作用。先前研究表明Gln缺乏促进体外PCV2感染。LIU等[22]进一步证实Gln缺乏在体内外均促进PCV2感染，同时还诱导自噬，抑制自噬可消除Gln缺乏对PCV2感染的影响；另一方面，ROS的产生可以诱导自噬，抑制ROS的产生，减轻因Gln缺乏而激活的JAK2/STAT3信号通路，从而抑制自噬诱导。这些结果表明Gln缺乏通过上调ROS介导的JAK2/STAT3信号通路激活自噬，从而促进PCV2感染，研究结果也强调补充Gln是有效的策略之一。

赭曲霉毒素A(OTA)是由曲霉属和青霉属等产毒真菌产生的一种真菌毒素。先前研究发现小剂量OTA促进PCV2在体外和体内复制，对于其机制进一步研究证实OTA诱导的自噬在体内外促进PCV2复制[23]；在此基础上，ZHAI等[24]探讨氨基酸衍生物牛磺酸对OTA促进PCV2复制的影响及作用机制，结果表明牛磺酸能抑制OTA对PCV2复制的促进作用，通过降低ROS水平和阻断OTA促进的自噬作用而实现，牛磺酸通过调节ROS/AMPK/mTOR信号轴来抑制自噬，从而抑制OTA促进的PCV2复制，这些发现为使用牛磺酸干预PCV2感染提供了理论依据。

另外研究证实氧化应激可促进PCV2复制，氧化应激诱导PCV2感染的PK15细胞自噬，用抑制剂或特异性siRNA阻断自噬可显著抑制氧化应激促进的PCV2复制，更重要的是自噬抑制显著增加了氧化应激处理的PK15细胞凋亡，是一种基于基因的自主细胞死亡程序，在自噬抑制条件下抑制细胞凋亡恢复PCV2复制，研究揭示氧化应激诱导的自噬通过抑制细胞凋亡途径促进PCV2在PK15细胞中的复制，从而导致病毒持续感染，研究结果为自噬与凋亡的互作及其在氧化应激促进PCV2复制中的作用提供了一个新的见解[25]；此外低浓度的非离子表面活性剂可以改变细胞膜的物理性质，从而增加药物的渗透性。HUA等[26]探讨了不同的非离子表面活性剂Tween-20、Tween-28、Tween-40、Tween-80、Brij-30、Brij-35、NP-40和TritonX-100对PK-15细胞PCV2感染的影响，并显示Tween-20能短暂改变PK-15细胞的表面形态，促进PCV2感染，研究结果可用于开发PCV2疫苗。

3.2 抑制病毒复制的外源性因素LIU等[27]证明Hsp90是PCV2感染宿主细胞所必需的，体外抑制Hsp90可以显著减少病毒复制。进一步对Hsp90抑制剂17-二甲胺乙胺基-17-去甲氧基格尔德霉素(17-DMAG)在BALB/c小鼠中PCV2感染和免疫应答影响进行研究，表明17-DMAG对BALB/c小鼠体内PCV2复制具有很高的抑制作用，作为一种抗PCV2感染的抗病毒药物具有潜在的应用价值[28]。进一步探讨Hsp90抑制剂17-烯丙氨基-17-脱甲氧基格尔德霉素(17-AAG)对PCV2复制的调节作用及其机制，发现17-AAG可以抑制PCV2感染诱导的NF-κB活化和Hsp90相关蛋白表达，在病毒吸附后用17-AAG处理PK-15和3D4/31细胞，PCV2复制减弱，17-AAG的存在也降低了PCV2感染细胞中Hsp90相关蛋白表达，这些结果突出了细胞蛋白在PCV2感染过程中的重要性，针对宿主因子的Hsp90抑制剂，例如17-AAG或改进的更有效的衍生物，可以提供一种新的抗病毒策略[29]。

一氧化氮(nitricoxide，NO)是一种重要的具有生物学功能的信号分子，参与多种抗病毒反应过程。由S-亚硝基谷胱甘肽(GSNO)产生的NO在对PK-15细胞和BALB/c小鼠PCV2感染的抗病毒活性研究中，发现NO生成化合物GSNO抑制PK-15细胞PCV2感染，表明NO及其供体GSNO作为抗PCV2感染的抗病毒药物具有潜在的应用价值[30]；XUE等[31-32]研究发现PCV2复制被一种形式的NO:NO·抑制，而PCV2对另一种形式的NO:NO+不敏感，NO体外抑制PCV2增殖主要是通过NO·实现，表明NO·形式对抗PCV2感染具有潜在作用。

此外，有机硒的主要成分硒蛋氨酸(SeMet)对赭曲霉毒素A(OTA)诱导PCV2复制的作用及其机制研究表明，OTA可以促进PCV2复制并激活自噬，下调p-AKT和p-mTOR的表达。另一方面，SeMet对OTA诱导的PCV2复制具有明显的抑制作用，同时SeMet能减轻OTA诱导的细胞凋亡自噬和上调OTA诱导的p-AKT和p-mTOR表达抑制，即SeMet通过激活AKT/mTOR通路，抑制OTA诱导的PCV2复制，因此补充SeMet可能是预防PCV2感染的有效策略[33]，自噬可能是开发新型抗PCV2药物的潜在标志。先前研究表明氧化应激可以促进PCV2复制，而黄芪多糖(APS)/硒可以抑制PCV2复制。LIU等[34]对硒化黄芪多糖(sAPS)对氧化应激诱导的PCV2复制是否有保护作用进行研究，发现H2O2通过3-甲基腺嘌呤(3-MA)和自噬相关基因5(ATG5)的敲除诱导自噬促进PCV2复制，sAPS通过激活PI3K/AKT抑制自噬，进而对氧化应激诱导的对PCV2复制的促进作用进行抑制。

其他一些研究包括牛蒡苷元对PCV2在人工感染仔猪体内的增殖具有明显的抑制效果，并能减轻由PCV2感染引起的病理变化[35]；伊维菌素作为新型的广谱、高效、低毒抗生素类抗寄生虫药，能抑制PCV2体外复制，减轻病毒感染对仔猪的影响[36]。

有证据表明，大多数现有疫苗未能有效降低猪群中感染PCV2猪的死亡率，对PCV2发病机制的认识不足是获得特异性抗病毒药物的主要障碍，这些发现增加了对PCV2发病机制的认识，并为PCVAD的可能控制方法进行了有效摸索。

4 影响PCV2复制的病毒自身因素

PCV有2个主要开放阅读框ORF1和ORF2。ORF1编码一种复制相关蛋白Rep，对病毒DNA的复制至关重要。有研究显示，Rep蛋白存在一些氨基酸缺失，并确定缬氨酸是重要的氨基酸，其导致PCV1在PK-15细胞中的复制效率高于在PCV2中，这些发现有助于探索猪病毒复制机制，并对PCV2疫苗的研制具有重要意义[37]。此前研究发现YiY-3-2-3菌株在ORF1区域有一个自然发生的点突变(G710到A710)，这导致Rep基因产物缩短(945～660 bp)，而Rep蛋白参与PCV2基因组复制。HU等[38]探讨这种突变对PCV2复制的影响，发现C端截短的Rep蛋白会降低病毒复制和感染性，表明PCV2的ORF1在进化过程中也可能存在有利和不利的突变。

另一方面，ORF5蛋白是PCV2中新发现的一种非结构蛋白，通过利用RNA测序研究PCV2 ORF5在感染PCV2的猪上皮细胞中作用，发现PCV2 ORF5可以通过转录抑制参与Ⅰ型干扰素(IFN)产生的基因来抑制Ⅰ型IFN表达，从而增强PCV2在猪上皮细胞中的复制[39]。进一步研究PCV2 ORF5蛋白对自噬和病毒复制的影响，发现ORF5在PCV2诱导的自噬中起重要作用，PCV2 ORF5诱导自噬以促进病毒在PK-15细胞中的复制，ORF5蛋白可触发PERK和eIF2a磷酸化和下游转录因子ATF4表达。此外ORF5蛋白激活AMPK-ERK1/2-mTOR信号通路，提示ORF5在PCV2诱导自噬中起重要作用，进一步揭示PCV2 ORF5通过PERK-eIF2a-ATF4和AMPK-ERK1/2-mTOR通路促进PCV2复制[40]。

此外，李佳暖等[41]以分离的1株PCV2d流行毒株PCV2RC160307为模板，通过融合PCR突变其Rep蛋白上的1个N-糖基化位点，成功构建自身环化感染性克隆HT-PCV2，转染ST细胞显示拯救成功的HT-PCV2病毒滴度，较分离的流行毒株RC160307及未糖基化位点突变的感染性克隆H-PCV2的病毒滴度有所提高，为PCV2复制机制的进一步研究及疫苗的研制奠定基础。

5 结语及展望

PCV2作为引发PCV相关疾病的病原，对世界养猪业造成了严重威胁。因此，进行 PCV2复制及感染致病机制的深入研究，对PCV2防制至关重要。病毒与宿主的相互作用是一个漫长的过程并不断地进化，在这一过程中，一方面宿主限制因子要抑制病毒；但同时，为了更有效的复制，病毒也会通过不同的机制拮抗宿主限制因子并逃逸其抑制作用。深入研究病毒与宿主间的相互作用，不但会丰富宿主抗病毒限制因子抑制病毒的认识，同时也可以更好地了解病毒本身，了解病毒所编码蛋白的功能。研究者通过对不同因素包括宿主因素、外源性因素以及病毒自身因素等研究，发现多种因素不仅能够抑制PCV2复制，还能调节促进病毒的复制。相信随着分子生物学、免疫学、基因工程技术的不断发展以及PCV2致病机制的深入研究，对这些影响因素更加透彻的了解将为PCV2的治疗及预防提供一些新的思路，找到治疗靶点来防治该病毒，进而达到净化目的。因此，对影响PCV2感染与复制的各类因素的研究具有重大意义，本研究综述的一些因素在抗病毒领域已经取得了阶段性进展，但如何在实际生产中运用有待进一步研究阐明。