蛛毒生物活性研究进展

丁丽君，巫秀美，张成桂，高鹏飞，严靖婷，杨自忠* ，赵 昱*

（1. 大理大学 昆虫生物医药研究院，云南省昆虫生物医药研发重点实验室，云南 大理 671000；2. 大理大学 昆虫生物医药研究院，药用特种昆虫开发国家地方联合工程研究中心，云南 大理 671000；3. 大理大学 药用昆虫及蛛形类生物资源数字化开发创新团队，云南 大理 671000；4. 云南省科学技术院，云南 昆明 650100）

蜘蛛入药已有几千年的历史，在诸多古代医学著作中都有记载，部分种类传承沿用至今。《本草纲目》记述“蜘蛛，微寒，有小毒”；《本草经集注》：“蜂及蜈蚣螫人，取置肉上，则能吸毒。又以断疟及干呕、霍乱”；《千金方》：“蜘蛛杵烂，醋和。先挑疮四畔令出血，根稍露，用药敷，干即易”[1]。可祛风镇惊，破瘀散结，解毒消肿。主治中风口歪、小儿惊风、疳积、喉风肿闭、疝气偏坠、瘰疬、痔漏、痈肿疔疮、顽癣、虫蛇咬伤。在近年研究中发现蜘蛛毒液在粗毒及单体水平上也具有镇痛、抗菌、抗癌等良好的生物活性[2]，及高活力、结构多样、专一性强等特点，引起了广泛关注。

有毒动物的毒液是自然界捕食—被捕食相互作用关系中进攻与防御生存策略演化的杰作。在捕食—被捕食长期博弈的共进化过程中，产毒动物形成了巨大的动物毒素分子多样性[3]；这些毒素分子往往作用于目标生物体关键生理蛋白质元件，如细胞膜受体和离子通道等，即动物蛋白多肽毒素的高活性、强专一性（可有效区分不同的膜受体和离子通道亚型）以及巨大的分子多样性[4]。蜘蛛拥有生态多样性的大集团[5]，作为新药来源具有巨大潜力，代表了一个巨大的潜在候选药物库。本研究就国内外近年蛛毒镇痛、抗菌等生物活性的研究进行综述。

1 转录组测序技术与蛛毒研究

1.1 转录组技术发展

转录组测序的研究对象是特定细胞在某一功能状态下所能转录出来的所有RNA 的总和，转录组de novo 测序是指在不需要物种基因组序列信息的情况下，用高通量测序技术对某一物种特定组织或器官在某一状态下的转录本进行测序、组装得到转录本序列信息。使用转录组测序技术，仅需少量毒腺样本即可预测转录水平上毒素的表达情况。通过将样本中提取的总体 RNA 逆转录成 cDNA 后进行高通量测序，再用生物信息学技术来确定样品中整体转录组的表达情况。

传统的测序技术是基于杂交技术的cDNA 芯片和寡聚核酸芯片法以及基于Sanger 测序的SAGE （Serial analysis of gene expression）和MPSS （Massively parallel signature sequencing）、全长 cDNA 文库、EST 文库等方法，但这两种技术存在一定的缺陷。杂交技术灵敏度有限，对于低丰度的mRNA，微阵列技术难以检测，也无法捕获到目的基因mRNA 表达水平的微小变化。Sanger 测序法的通量较低，不能满足大批量测序的要求。相比于杂交技术和 Sanger 测序技术，二代测序技术具有更高测序通量、更长测序片段、更短运行时间等优点，目前将运用第二代测序技术的转录组分析称为 RNA-Seq[6-7]。二代测序平台主要包括454 Life Sciences 公司推出的454 测序技术、Illumina公司和 ABI 公司相继推出的Solexa 和SOLID 测序技术等，其中454 测序技术平台最早实现商业化。在过去10 年间，Illumina 公司的Solexa 技术，即边合成边测序 （Sequencing by synthesis，SBS） 技术发展迅速，其 HiSeq 系列的测序平台逐渐成为二代测序技术中最被广泛应用的平台。

1.2 转录组技术在蜘蛛毒液研究中的作用

毒液成分的多样性、巨大的动态范围，及其它物理化学参数解释了为什么很多的毒液成分目前还未被发现。蜘蛛个体小、分泌毒液量少而且在野外环境中采集困难，毒液成分复杂、蛋白多肽分离困难，不可能在个体或只是粗毒水平上进行深入的研究。因此，构建毒腺cDNA 文库，通过分子生物学手段获得毒腺内表达的毒素分子序列信息，对其进行功能预测，为毒液成分生理活性研究奠定基础。直到十年前，大多数毒素都是在蛋白质水平上进行测序，现在大多数报告出的毒素序列都是由mRNA 或cDNA 测序产生的，这为以前难以获得的信息打开了大门。但是，多肽活性往往是通过同源序列搜索推断的，并没有进行体外或体内试验的验证，因此神经毒素的靶点特异性仅通过转录本序列进行预测并不完全可信。最后，通过分离鉴定获得毒素单体时，用膜片钳技术对靶点特异性和效力进行研究，很多毒素在毫微摩尔浓度下就有作用效果。然而，毒性作用还取决于猎物的类型、神经毒素对特定通道的特异性以及猎物所表达的受体[8-9]。

主要技术流程为提取毒腺总RNA，利用带有Oligo （dT） 的磁珠与ployA 进行A-T 碱基配对结合来分离出mRNA，将mRNA 随机断裂成200 bp 左右的小片段，以 mRNA 为模板合成 cDNA，将合成的cDNA 双链进行末端修复、加碱基A、加测序接头，然后 PCR 扩增制备得到文库，最后将文库上机测序。获得的短读 （reads） 使用Trinity 重新组装，然后用Trinotate 执行自动转录组的功能注释，通过已知序列进行同源性搜索，蛋白质结构域识别，信号肽和跨膜域预测，并利用数据库进行功能注释 （Uniprot/NR/KEGG/GO/COG）[10-11]。通过序列同源性及已知毒素序列结构特征寻找可能表达毒素的序列，预测其前体肽、信号肽、分子量并进行蛋白质家族分析。

2 蛛毒中神经毒素多样性

2.1 神经毒素结构

蜘蛛毒液由螯肢内的毒腺生产和储存，蜘蛛毒液成分通常可分为四类：小分子化合物（多胺、无机盐等）、抗菌肽（只有少数种类具有）、神经毒素、蛋白质和酶[12]。在传统中医药中，蜘蛛入药经常用于治疗风湿痛以及中风、癫痫、面瘫等神经系统疾病，而神经系统的活动与各类离子通道有着密切的联系。蜘蛛毒素具有作用离子通道的高活性、强专一性，代表一类潜在的治疗神经系统疾病的药物候选库。富含半胱氨酸的神经毒素是毒液成分中极具研究价值的部分，存在于大多数蜘蛛毒液[13]。

蜘蛛毒液通常含有几十种不同的富含半胱氨酸的肽，通常分子量在3 ～ 9 kDa 之间，含有3 对或者更多二硫键。由于二硫键配对方式不同而形成不同的结构模体。抑制剂胱氨酸结 （Inhibitor cystine knot,ICK） 采用C1-C4、C2-C5、C3-C6 的二硫键配对方式，其中C1-C4、C2-C5 两对二硫键以及中间的肽链形成一个大环，而C3-C6 二硫键从环中穿过使得在空间上形成一个类似于“结”的拓扑结构，这种胱氨酸结构通常被称为胱氨酸结[14]。二硫键定向β-发夹结构 （Disulphide-directed beta-hairpin, DDH），虽然没有形成胱氨酸结，但包含两对强制性二硫键稳定的反平行发夹；Kunitz 型结构中六个高度保守的半胱氨酸以C1-C6、C2-C4、C3-C5 的方式形成三对二硫键。许多肽以ICK 为核心基序，但含有其它的半胱氨酸。一个常见的变化是在简单ICK 基序的C5 和C6 之间的β-发夹的回路中包含了第四个二硫化物桥[15]。

2.2 毒素作用特异性

在ArachnoServer 数据库中，约46% 通过延迟不同亚型的电压激活钠通道 （NaV） 的失活 （如：δ-ctenitoxin-pn2c, O76199）， 抑 制 其 开 放 （ 如：μ-theraphotoxin-Hs2a_1, P83303），或改变其潜在的激 活 极 限 （ 如：β-theraphotoxin-Cm1a, P84507）。约37% 抑制电压门控钙通道 （如：ω-ctenitoxin-Cs1a, P81694），15%抑制电压门控钾通道 （KV，如：kunitz 型κ-PI-theraphotoxin-Hs1a, P68425）。其它靶点包括酸敏感离子通道 （如：π-theraphotoxin-Pc1a、P60514），天冬氨酸-谷氨酸受体 （如：γ-ctenitoxin-Pn1a、P59367），钙激活钾通道 （如：κ-hexatoxin-Hv1e[sic]、S0F1M9） 和瞬时受体电位 （TRP） 通道 （如：τ-theraphotoxin-Gr1a、M5AXK5）[16]。

毒素的作用不一定局限于一种通道 （β/κ-theraphotoxin-Hlv1a, B3EWN3；μ/ω-theraphotoxin-Hs1a, B3FIR8），还可兴奋细胞膜上的离子通道负责适当的信号转导。钙通道参与突触前细胞释放神经递质，电压门控钠通道使动作电位沿着可兴奋细胞传递，电压门控钾通道对恢复去极化细胞的静息状态至关重要。通道功能的中断（如：通过抑制或通过毒素非自然激活）可能影响运动、呼吸和心脏功能，导致包括抽搐、瘫痪在内的各种症状。

3 蛛毒具有镇痛活性

3.1 蛛毒作为钠离子通道调节剂

由于电压门控钠离子通道 （NaV） 在中枢神经系统、外周神经系统、心脏、平滑肌和骨骼肌的动作电位发生和传播中起主要作用，参与运动和感觉过程。因此，NaV通道功能至关重要，是多种毒素的靶点，可与至少6 个特定的通道受体位点相互作用。调节离子通道的毒素可能的影响有以下三种中的一种或多种：激活、使失活和对离子通道的选择性。这使钠离子通道成为动物神经毒素的主要作用位点，以使猎物尽快麻痹或致死。有9 种哺乳动物亚型，被称为NaV1.1-NaV1.9，几项显著的遗传研究结果证明了人类NaV1.7 （hNaV1.7） 作为镇痛靶点的有效性，且蜘蛛毒素的结构特征对多数疼痛模型都有良好的作用[17-18]。

Davus fasciatus毒液中发现了一种名为μ-TRTXDf1a 的强效NaV抑制剂，电生理实验显示Df1a 抑制所有NaV亚型 （hNaV1.1- hNaV1.7）。Df1a 还可减缓NaV1.1、NaV1.3 和NaV1.5 的快速失活，并调节大多数NaV亚型的激活和失活的电压依赖性，可逆转NaV激活剂OD1（一种增强hNaV1.7 的蝎子毒素）诱导的疼痛[19]；Ornithoctonus hainana毒液中分离的HNTX-III 是一种对NaV具有相似选择性的抑制剂，对NaV1.7、NaV1.2 和NaV1.3 具有相似的选择性，但对NaV1.4 和NaV1.5 没有选择性。在完整的弗氏佐剂模型和炎症性疼痛福尔马林模型中，HNTX-III 可逆转与吗啡相当效力的痛觉过敏。在非神经损伤的疼痛模型中，HNTX-III 与美西律相比抑制了痛觉且不会引起运动协调的损害[20]。μ-TRTX-Hhn1b （HNTXIV） 能有效逆转腹缩模型的急性伤害性疼痛，并显著降低福尔马林模型疼痛评分，μ-TRTX-Hhn1b 在两种模型上的效率均与吗啡相当。在脊神经模型中，μ-TRTX-Hhn1b 对触痛的逆转作用比美西律更长、更高[21]。蜘蛛毒素在以上模型中的良好作用效果证明了其作为镇痛药物开发的潜力。

在天然蜘蛛毒素基础上进行多肽修饰，改变其特定位点氨基酸或疏水性等可增强对钠离子通道的抑制作用。Ornithoctonus hainana毒液中分离出的µ-TRTX-Hhn2b （HNTX-I），在哺乳动物钠离子通道（包括hNaV1.7）表现微弱的活性，用天冬酰胺取代S23或用天冬氨酸取代H26，对抗hNaV1.7 的活性增强。此外，多个位点突变结合可提高效力，与原HNTX-1在hNaV1.7［IC50= （0.036 ± 0.007） µM］ 的作用相比，生成的模拟E1G-N23S-D26H-L32W 提高了300 倍效能[22]。结构模拟表明，修饰肽的荷电表面和疏水表面可提高与hNaV1.7 的亲和力，而可变氨基酸残基可能决定药理作用特异性，为针对hNaV1.7 通道的药物设计提供了思路。

μ-TRTX-Tp1a （Tp1a） 来自Thrixopelma pruriens蜘蛛毒液，是一种NaV1.7 抑制剂。重组合成的由33个氨基酸组成的多肽对NaV1.7 作用选择性较强，与天然酰胺化形式 （IC50= 2.1 nM） 相比，Tp1a 的C 端酸形式对NaV1.7 抑制率降低 （IC50= 11.5 nM）、缔合率降低，表明C 端与hNaV1.7 相互作用。与大多数可调节NaV通道的蜘蛛毒素不同，Tp1a 抑制了hNaV1.7，但没有显著改变其激活或失活的电压依赖性。Tp1a 通过逆转小鼠足底注射OD1 引起的自发性疼痛而被证明具有镇痛作用[23]，因此，Tp1a 结构可能有助于指导改进NaV1.7 抑制剂的开发。

从Pamphobeteus nigricolor毒液中分离出的μ-phraphotoxin-Pn3a （Pn3a），与其它对NaV亚型相比，对NaV1.7 的选择性提高了40 倍～ 1 000 倍。尽管在小直径背根神经节、脊髓切片和NaV1.7 激活引起的疼痛小鼠模型中有活性，但Pn3a 单独在福尔马林、卡拉胶或弗氏完全佐剂诱导的啮齿动物疼痛模型中没有镇痛活性。然而，当联合使用亚治疗剂量的阿片类药物（羟考酮或丁丙诺啡）或脑啡肽酶抑制剂时，这些选择性NaV1.7 抑制剂产生了强大的镇痛作用[24]。设计出17 个Pn3a 类似物，利用膜片钳电生理学方法测定其在hNaV1.7 位点的活性。带正电荷的氨基酸K22和K24被确认为Pn3a 活性的关键氨基酸，而疏水残基Y4、Y27和W30的去除会导致效能的丧失，而带负电荷的D1和D8残基被带正电荷的赖氨酸取代导致效能的增加（＞13 倍）。将D8突变为天冬酰胺可使Pn3a 在NaV1.7 的效力得到最大的改善（20 倍），同时保持对主要目标NaV1.4、NaV1.5 和NaV1.6 >100 倍的选择性。突变体Pn3a [D8N]在体内保留了镇痛活性，在临床相关的术后疼痛小鼠模型中，剂量比原Pn3a 低3 倍即可显著减轻机械触痛且不引起运动不良反应[25]。为合理设计强效、选择性的多肽NaV1.7 抑制剂，以开发更有效、更安全的镇痛药物，并进一步研究NaV1.7 在疼痛中的作用提供了基础。

来自Glammostola Portori蜘蛛毒液的GpTx-1在NaV1.7 （IC50= 10 nM） 上表现出较强的活性，C端的W29、K31和F34残基是对NaV1.7 拮抗作用的关键。GpTx-1 在局部给药时显著减少OD1 诱导的疼痛行为，但在系统给药时缺乏疗效。可能是由于最大耐受全身剂量 （0.1 mg/kg） 在后爪周围神经末梢没有达到足够高的浓度对NaV1.7 进行抑制[26-27]。对NaV1.7 （IC50= 10 nM） 的选择性比对NaV1.4 和NaV1.5 的选择性分别高20 倍和1 000 倍。用A 取代F5，对NaV1.4 提高300 倍的选择性。最终设计出的 [A5, F6, L26, R28] GpTx-1 （IC50= 1.6 nM），其对NaV1.4 和NaV1.5 的选择性提高了1 000 倍[27]。疏水残基的数量和类型以及它们在表面的呈现方式决定了GpTx-1 对膜的亲和力，改变这些残基可以对抑制NaV的活性产生显著影响[28]。结构—活性关系研究为实现对NaV1.7 的高效和选择性提供了可能。

3.2 钙离子通道调节剂

电压门控钙通道 （CaV） 存在于突触前神经末端，通过激活CaV通道使钙离子进入细胞，直接影响膜电位，促进电兴奋性、重复放电模式、兴奋-收缩耦合和基因表达，是神经系统的重要组成成分。天然钙通道一般分为6 种亚型 （T-、L-、N-、P-、Q-和R-），是根据它们的电生理性质和对各种激活、拮抗剂和离子的敏感性来归类的[29]。它们存在于疼痛调节区，如脊髓、背根神经节和脑干，表明这些类型的CaV在中枢神经系统疼痛相关信息的处理中起着至关重要的作用。

Phα1β 是Phoneutria nigriventer毒液分离纯化的多肽，选择性地抑制TRPA1 激动剂异硫氰酸烯丙酯（AITC） 对人胚肾293 细胞、人神经母细胞瘤细胞和背根神经节神经元的钙反应和电流。鞘内或足底给药低剂量的Phα1β 即可减轻急性痛觉和由AITC 引起的机械疼痛和痛觉过敏，对辣椒素或低渗溶液产生的疼痛反应无效。值得注意的是，Phα1β 可减轻硼替佐米诱导的TRPA1 依赖性神经性疼痛反应[30]。其重组形式CTK 01512-2 基于阻断CaV2.2 （N 型），减少神经递质谷氨酸在脊髓背角的释放。这些肽在大鼠不同疼痛模型中表现出镇痛作用，且Phα1β 和CTK01512-2 剂量高于镇痛剂量下，具有良好的安全性[31-32]。

Tx3-3 是一种从Phoneutria nigriventer毒液中分离出来的另一种多肽毒素，它优先抑制P/Q 和R 型钙通道。在神经病理性疼痛模型中，Tx3-3 显示出持久的镇痛作用。鞘内注射Tx3-3 可降低小鼠坐骨神经损伤产生的机械性痛觉和链脲佐菌素诱导的小鼠和大鼠的痛觉，但对炎症性疼痛无效，有望作为一种新的治疗药物来控制神经病理性疼痛[33]。

3.3 与其它镇痛靶点作用

P2XRs 是ATP 门控非选择性阳离子通道，包含七个嘌呤受体亚基，分别为P2X1-P2X7。药理学研究表明P2X3Rs 参与急性疼痛、炎症性疼痛、慢性神经病理性疼痛、内脏疼痛、偏头痛和癌症疼痛[34]。

哺乳动物感觉神经元中表达的P2X3 嘌呤受体在包括痛觉的多个过程中发挥关键作用。从蜘蛛Geolycosa sp.的毒液中分离出了一种肽，命名为Purotoxin-1 （PT1），这是我们所知的第一个对P2X3受体产生强选择性抑制作用的天然分子。PT1 显著减缓了这些受体脱敏的去除[35]。该肽在炎症性疼痛的动物模型中显示出强大的镇痛作用，代表了开发新的镇痛药物的一个非常有吸引力的分子基序。

δ-Ctenitoxin-Pn1a （δ-CNTX-Pn1a） 来自巴西流浪蜘蛛Phoneutria nigriventer毒液，在炎症性疼痛模型、神经性疼痛模型及在前列腺素E2 诱导的急性疼痛模型中，都有良好的镇痛作用。δ-CNTX-Pn1a 的镇痛作用既通过CB1 受体涉及到大麻素系统，也通过δ 受体涉及到阿片系统[36]，为镇痛药物的设计提供了方向。目前已发现大量具有镇痛活性的蜘蛛毒素，在此基础上需要更详细的结构—功能研究来促进新型镇痛药物的开发。

4 蛛毒的抗菌活性

抗菌肽 （AMPs） 也被称为溶细胞肽或阳离子肽。AMPs 通常具有较高正电荷和大量疏水氨基酸。它们作为动物免疫系统的主要成分广泛分布，也存在于各种节肢动物毒液中，如：蚂蚁、蝎子、蜜蜂和黄蜂[37]。AMP 可破坏细胞膜的完整性，因为它们带正电荷的氨基酸侧链与带负电荷的磷脂或其它带负电荷的表面分子的头部基团相互作用被吸引到细胞膜表面。在膜附近，AMPs 表现出两亲α 螺旋结构，这种两亲性结构有助于AMPs 插入细胞膜。α-螺旋带正电荷的部分与带负电荷的磷脂头部基团相互作用，α-螺旋的疏水部分与磷脂尾部相互作用[13]。到目前为止，AMPs 只在Cupiennius Salei蜘蛛的毒液和Zodariidae、Lycosidae和Oxyopidae毒液中发现[8]。

从穴居狼蛛Lycosa singoriensis的毒液中分离出的一种肽 lycosin-I 是一种有效的念珠菌的抑制剂。lycosin-I 的MIC50值可达到8 µg/mL。试验显示，lycosin-I 在2 h 内减少约70%的菌落形成单位。此外，lycosin-I 在高浓度Mg2+下仍能保持其强大的抗真菌能力。当lycosin-I 的浓度从1 MIC 增加到8 MIC 时，无论是氟康唑敏感型，还是耐药型热带念珠菌，其生物膜代谢活性均明显下降。生物膜抑制浓度 （BIC50） 和生物膜根除浓度 （BEC50） 分别约为32 µg/mL 和128 µg/mL。研究表明，lycosin-I 是一种高效、耐盐、抗生物膜性能强的有效真菌抑制剂[38]；分离并鉴定出的另一种抗菌肽lycosin-II，具有典型的线性两亲性和阳离子的α-螺旋构象，对从患者体内分离出来的耐药菌—给感染治疗带来了巨大挑战的多重耐药的鲍曼氏菌显示出强大的抑菌作用。lycosin-II 的抑制能力可能来源于其与细胞膜的结合，因为Mg2+可以通过与结合位点竞争降低其抑菌力[39]。数据表明Lycosin-II 可能是治疗耐药细菌感染的新型抗生素开发的先导。

从Ornithoctonus hainana毒液分离纯化出的Ohdefensin 抗菌肽，与其它节肢动物抗菌肽具有显著的序列相似性，对包括革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和真菌在内的微生物具有抗菌活性，MIC 低至1.25 µg/mL[40]；Acanthoscurria gomesiana毒液中发现的新肽U1-TRTX-Agm1a 与Acanthoscurria paulensis中U1-TRTX-Ap1a 仅存在一个氨基酸差异，对大肠杆菌、阴沟肠杆菌和白色念珠菌菌株具有良好活性[41]；从Vitalius dubius毒液中分离出的VDTX-I，对14种微生物（包括真菌、酵母菌和细菌）进行了抗菌试验，在白色念珠菌，吉耳菌，黄体小球菌和大肠杆菌中，3.12 ～ 100 µM 时有剂量反应。VDTX-I 约5 min 即可抑制细菌生长，比链霉素作用更快[42]；来自Lachesana tarabaevi蜘蛛毒液的抗菌肽Latcarin 2a （LTC 2a） 具有广谱抗菌活性，化学合成和重组的LTC 2a 对抑制革兰氏阳性枯草芽孢杆菌和革兰氏阴性大肠杆菌等目标菌株生长能力同等有效[43]；Lasiodora sp.粗毒对细菌中的气单胞菌、枯草芽孢杆菌和黄体微球菌均有杀灭作用，对真菌中假丝酵母菌和白色念珠菌均有杀灭作用，对肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌及热带念珠菌和克鲁氏念珠菌均有抑菌作用。最低抑菌浓度 （MIC）、最低杀细菌浓度 （MBC） 和最低杀真菌浓度 （MFC） 为3.9 ～ 500 µg/mL[44]；U1-SCRTX-Lg1a 来自Loxosceles sp.毒液，对革兰氏阴性菌有活性，该肽的序列与Loxosceles中多个物种的磷脂酶D 区域非常相似[45]。研究数据表明诸多蜘蛛毒素有着良好的抗菌效果，作为抗生素开发有着巨大潜力。

Lachesana tarabaevi毒液中分离出一种独特的抗菌肽 CIT1a。构建一个由四环素依赖人巨细胞病毒启动子控制的表达CIT1a 基因的质粒载体，用含有CIT1a 基因的质粒载体转染人胚胎肾HEK293 细胞，转基因的控制表达导致感染细胞内沙眼细胞存活率显著降低，表明抗菌肽在病原体生命周期的早期发挥了强大的抗衣原体作用[46-47]；从Lycosa erythrognatha毒液中分离出抗菌肽 LyeTxI，与LyeTxI 相比作为结构修饰LyeTxI-b 具有乙酰化N-末端和组氨酸残基的缺失，二级结构是一个明确的螺旋段，从第二个氨基酸到酰胺化的C 端疏水和亲水面之间没有明确的划分。此外，LyeTxI-b 对革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌具有较强的抗菌活性，比天然肽对大肠杆菌的抑制活性高10 倍[48]。结果表明，蜘蛛毒素代表了一系列开发新的抗生素潜在的药物模板。

一系列耐药菌株的出现严重威胁了人类的生命健康安全，新型抗生素的研发势在必行，蜘蛛毒素为其提供了有价值的天然分子模板。

5 蛛毒作为杀虫剂

在数量庞大的节肢动物中，超过10 000 种被认为是有害生物，造成了农作物产量的大量损失，目前主要通过使用化学杀虫剂加以控制。但这些农用化学品的广泛使用导致的遗传选择压力使耐杀虫剂节肢动物快速发展，以及影响人类健康和造成环境污染。理想的生态友好型生物杀虫剂对昆虫来说应该是具有口服或者局部活性，即使在极端的野外条件下也是稳定的，具有快速杀死昆虫或使目标昆虫失去能力，并对人类和其它脊椎动物包括鱼类和鸟类不起作用[49]。它们还应对目标害虫的授粉者和天敌等有益昆虫无害，不应造成生物累积或形成有害的降解产物。蜘蛛是最成功的节肢动物捕食者之一，其毒液已经被证明是杀虫肽的丰富来源，可以通过调节离子通道而导致昆虫瘫痪或死亡[50]。这些肽通常含有特殊的二硫键排列，能稳定存在于昆虫的肠道和血淋巴中。

Nephila clavata毒液中鉴定出一种新型毒素μ-NPTX-Nc1a，Nc1a 对蟑螂背侧未配对正中神经元 （DUM） NaV和KV通道有抑制作用，Nc1a 对蜚蠊的LD50= 573 ng/g[51]；平甲蛛属Loxosceles蜘蛛毒液中LiTx 家族以杀虫活性而闻名，它们对农业害虫如草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda和斜纹夜蛾Spodoptera cosmioides具有杀虫活性[52]；Araneus ventricosus毒液可阻断美洲大蠊Periplaneta americanaDUM 的NaV电流，美洲大蠊注射该毒液后出现明显的中毒症状 （LD50= 30.7 mg/g）[53]。数据表明，这些毒素作为杀虫剂应用有着较强的有效性和靶向性。

寄生型的小型蜂巢甲虫Aethina tumida以花粉、蜂蜜和欧洲蜜蜂幼虫为食，对养蜂业造成了严重的经济损害。将蜘蛛毒神经毒素ω-hexatoxin-Hv1a （Hv1a） 连接snowdrop lectin （Galanthus nivalis agglutinin，GNA）N 端或C 端构建重组Hv1a/GNA 和GNA/Hv1a 融合蛋白。两种毒素对甲虫幼虫的毒性相似 （LD50分别为1.5 nmol/g 和0.9 nmol/g），而注射大于200 nmol/g对成年蜜蜂的存活无影响。GNA/Hv1a 喂食幼虫的杀虫作用明显高于Hv1a/GNA （LC50分别为0.52 mg/mL和1.14 mg/mL ），但对成虫的毒性相近。用GNA/Hv1a 注射到卵内后，幼虫的存活率显著降低[54]。该毒素可作为杀虫剂的先导，有望作为新型生物杀虫剂开发。

6 蛛毒与心血管疾病

心脑血管疾病是危害人类健康和生命的重大疾病，特别是在老年人群中患病率较高，在我国死亡率居各种疾病之首[55]。蜘蛛毒液中的活性多肽有望开发为心脑血管药物，目前已取得了初步的研究进展。

Grammostola spatulate毒液中分离出的肽GsMtx-4 能特异性地阻断星形胶质细胞中的阳离子通道，并抑制成熟星形胶质细胞和心肌细胞中的容积激活电流。其作用的特异性表现为对兔心室细胞和大鼠星形胶质细胞的静息电位无影响。在不改变静息动作电位的情况下，对兔心脏扩张所引起的心房颤动有良好的效果[56]，可能开发为一种新的用于治疗纤颤抗心律失常药物。

Lasiodora sp.蜘蛛毒液及来自Lycosa singoriensis的Lycosin-I 可诱导大鼠主动脉环血管扩张，这种扩张依赖于有功能的内皮细胞的存在，可被一氧化氮合酶 （NOS） 抑制剂L-NAME 所消除[57-58]，有可能通过对血管内皮依赖性舒张作用成为一种降压药。

7 蛛毒具有抗肿瘤活性

目前关于肿瘤治疗的难题仍未攻克，抗肿瘤药物一般副作用较强，且癌细胞对化疗药物的耐药性使治疗更加复杂。肿瘤细胞在增殖和转移过程中往往涉及离子通道的异常变化，而毒素分子往往作用于目标生物体关键生理蛋白质元件，如：细胞膜受体和离子通道等[59]，一些蜘蛛毒素已有研究证实具有抑制肿瘤或癌细胞的能力。

胶质母细胞瘤具有高发病率和高死亡率，因此开发新治疗方法的研究十分紧要。Phoneutria nigriventer毒液 （PnV） 可增加自然杀伤细胞、单核细胞和巨噬细胞在胶质母细胞瘤的浸润，并可降低肿瘤的大小，将毒液进一步纯化得到LW-9，可增加巨噬细胞吞噬作用[60]，且在肿瘤中的巨噬细胞数量增加而脾脏中没有增加，说明PnV 激活的巨噬细胞优先被引导到肿瘤[61]。

Gomesin 来 自Acanthoscurria gomesiana蜘 蛛 毒液，它兼具稳定性、抗癌和细胞穿透特性。通过在支架中加入D-氨基酸设计了一种改进的无毒的环状Gomesin 类似物，保留了进入癌细胞的能力，可作为传递药物的支架且不损害健康细胞[62]，证明了蛛毒可作为模板设计抗癌药的潜力。

8 总结与展望

近年来，随着转录组技术和蛋白组技术的发展，发现新的活性多肽的速度越来越快，这些发现让我们认识到蛛毒作为生物医药开发的潜力，也获得了诸多具有生物活性的分子模板，在天然肽基础上进行修饰可以扬长避短获得活性更强、副作用更小的重组肽。

现已鉴定的近5 万种蜘蛛中只有少数物种进行了毒素相关研究，且研究的深度和广度都有待发展，蛛毒作为生物药开发有着巨大潜力，更多具有研究价值的蜘蛛毒素等待被开发利用。我们不可能针对每种蜘蛛的每种毒素都进行分子水平的药理活性探索，因此如何在众多物种的大量毒素中寻找到符合人类需求的毒素信息是我们面临的重要问题。