宏基因组技术在感染性疾病中的应用

孙 波，郑光辉，高 阳，王亚东，洪维礼，吕 红，张国军，康熙雄

感染性疾病一直是全球的重大医疗负担，2019年WHO发布的全球十大健康威胁中，有6种与感染性疾病有关，其中包括流感、抗生素耐药、埃博拉或其他病毒、疫苗犹豫、登革热及艾滋病。尤其是2020年，随着新型冠状病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)在世界范围内传播，使感染性疾病的诊断和治疗处在了更重要的位置[1]。目前对于感染性疾病的临床实验室诊断主要基于传统的诊断方法，如病原体的培养[2]、核酸扩增检测、免疫检测[3]等。近年来，随着新技术如16S基因测序[4]、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry,MALDI-TOF MS)[5]的临床应用，大大提高了实验室应对感染性疾病的诊断能力。但由于技术所限，许多传统方法无法获得病原体信息(如50%神经系统感染无法获取病原体[6])，故需要精密度更高、应用更广泛的新技术来应对越来越复杂的感染性疾病。下一代测序(next generation sequencing，NGS)是一种可对成千上万到数十亿个DNA片段独立和同时进行高通量、大规模并行测序的方法[7]。近年来，NGS已经从研究工具转变为临床实验室诊断方法，并且在临床微生物实验室中的应用越来越广泛。这些应用包括全基因组测序(whole genome sequencing,WGS)、下一代靶向测序(target next generation sequencing,tNGS)和宏基因组测序(metagenomics next generation sequencing,mNGS)等;而以上各种应用由于其自身的侧重点不同而使得操作程序有所差异[8]。其测序方法可以在不需要PCR扩增的情况下，直接对原始DNA/RNA样品进行测序，对CG核苷酸没有偏好，可以直接检测和获取甲基化信息。对宏基因组的研究最早可追溯到20世纪80年代，研究人员在一篇土壤微生物的研究报道中首次提出宏基因组学(metagenomics)的概念[9]。mNGS是一种可以直接从患者标本中进行泛核酸检测的方法，该方法不会有选择地放大特定靶标序列,因为它会对所有样品中的核酸放大和并行测序,允许无差别检测所有微生物(如细菌、病毒、寄生虫和真菌)、抗体、毒力因子,甚至宿主生物标志物等[10～12]。与传统实验室诊断方法不同，mNGS允许直接从患者标本进行泛核酸检测，而无需病原体的培养。此方法将样本内的所有核酸提取并对其进行平行测序，包含对宿主和病原体的所有核酸进行测序，具有直接从患者标本进行无假设诊断的优势，这种方法既可以将DNA作为测序目标，也可将RNA作为研究对象，且针对RNA的mNGS可称为宏转录组NGS[13]。此外，mNGS可以从感染源或游离DNA(cell free DNA,cfDNA)中检测完整的微生物。cfDNA是微生物死亡裂解后过滤到血液或无菌体液中的小核酸片段，可作为远端感染部位(如肺炎时的肺部)的读数[14,15]。了解这些方法的差异和局限性是很重要的。例如，若基于RNA的方法不包括在mNGS程序中，RNA病毒将无法被检测到，或者基于转录组的分析将不能用于研究宿主的免疫反应。已有大量的文献证明，mNGS可以作为一种针对于多个系统感染的诊断工具，例如中枢神经系统感染[16]、血流感染[17]、呼吸道感染[18]、胃肠道感染[19]、假关节感染[20]、尿路感染[21]和眼部感染[22]。可鉴定出的病原体包括细菌、分枝杆菌、RNA病毒、DNA病毒、酵母、丝状真菌和寄生虫。在少数病例中，经典的诊断手段仍然发挥着重要的作用，而mNGS在检测以前治疗过的患者中新的、罕见的、非典型病原体导致的感染方面特别成功，并且在多种病原体导致的协同感染与耐药基因检测方面也发挥着重要的作用。本文对mNGS在感染性疾病中的应用进行综述，以求更好地支持临床诊断。

1 mNGS作为常规临床检测手段的前景

有研究表明，与传统的诊断相比，mNGS具有更高的敏感性，因此对mNGS的应用前景更具有指导意义。一项针对于不同标本来源的横向对比实验显示，mNGS的总体临床检测敏感度和特异度分别为50.7%和85.7%，而传统方法的诊断敏感度和特异度分别为35.2%和89.1%，值得注意的是，mNGS在结核杆菌、病毒、厌氧菌和真菌方面的检测尤其突出[23]。此外，与液体培养相比，mNGS在鉴定假关节感染中的病原体方面显示出更高的敏感度，可达到88%[95%置信区间(confidence interval,CI)，77.1%～94.5%]，特异度为80%(95%CI，71%～88%)[24]。越来越多快速测序技术的发展，有助于将mNGS转化为传染病的常规诊断工具。由于微生物实验室目前依然采用传统微生物鉴定方法，即使是自动化的仪器依然依赖基于生长的方法，需要较长时间得到结果，导致漏诊或延迟诊断以及临床医师通过经验性地使用广谱抗生素或抗真菌药物的滥用。因此我们认为mNGS可以作为一种非侵入性的替代工具，用于分析那些感染患者的容易获得的样本(如血液、尿液等)。我们需要更多的临床经验来支持这些新的检测思路的实施，例如，在mNGS鉴定病原体时，需要明确哪些传染病和这些疾病的哪些阶段适合收集易于获取的样本等。2020年在中国发布了《中国宏基因组学第二代测序技术检测感染病原体的临床应用专家共识》，该共识对于宏基因组学在病原菌的检测、耐药基因检测、宿主免疫监测、病原体定量、疑难罕见病等领域中推动感染性疾病精准诊疗的发展。

2 mNGS对于罕见病原体的检测

有文献报道1例罕见的慢性神经钩端螺旋体病，患者为14岁男孩，急性发作后持续数月，传统的方法如脑脊液培养、血清学试验和实时荧光定量PCR都未能发现导致感染的病原体。特别是各种中枢神经系统感染中检测较为罕见的侵入性病原体。对脑脊液样本进行mNGS检测，确定了钩端螺旋体特异性序列，随后的血清学检测和PCR检测也确认了钩端螺旋体感染[25]。另一案例显示，临床医师通过mNGS分析脑脊液样本，诊断出1例致死性脑膜脑炎，并迅速鉴定出一种罕见的传染源Balamuthia mandrillaris[26]。Ai等[27]于2017-07报道了1例由伪狂犬病毒(pseudorabies virus,PRV)引起的传染性眼内炎，结果表明，PRV可能通过与猪污染物的直接接触而感染人类。Wylie等[28]使用mNGS发现痤疮丙酸杆菌(皮肤正常菌群的一部分)是慢性脑膜炎的原因之一，与对照组相比，临床样本中痤疮丙酸杆菌特异性序列数量更多，基因组覆盖率高，治疗效果也支持他们的结论。以上案例显示，mNGS可以为罕见病原体提供精准诊断思路，更好地解决临床感染问题。在神经系统感染性疾病中，建议mNGS与常规微生物检测联合应用，可提高中枢神经系统感染的病原学诊断。

3 mNGS对于协同感染的检测

mNGS的另一个优点是它可以在一次试验中同时检测到多种病原体，协同感染的患者表现出不同的免疫特征(对病原体攻击的抵抗)，而且一个病原体可能在不同的患者中表现出毒性差异。2016年，Sardi等[29]通过mNGS检测，在巴西2例已确诊寨卡病毒感染的患者身上发现了寨卡和基孔肯雅病毒(Chikungunya fever，CHIKV)的协同感染。在这两个案例中，CHIKV的结果都被特异性的RT-PCR验证，这强调了无偏倚的mNGS在鉴定协同感染方面的潜在应用价值。在另一项研究中发现艰难梭菌可能与产气梭状芽胞杆菌和腹泻患者粪便样本中的4种病毒属同时存在，虽然可以通过其他方法证实这些微生物的存在，但无法区分是哪种病原体导致了疾病。而对临床医师来说，确定候选治疗的主要药物是一项挑战，联合治疗是对抗协同感染的常见策略，但随着mNGS技术越来越多地应用于临床，个别病例中可能同时检测到更多假定的病原体。只有深入了解这些病原体的致病特性，才能解决协同感染的问题。

4 mNGS对于耐药基因的检测

mNGS可以对病原体进行耐药基因的检测，常规药敏试验(antimicrobial susceptibility test,AST)或传统耐药基因检测方法需要对病原菌进行分离，耗时较长且操作复杂，对不可培养的细菌无能为力。mNGS能够检测病原体的基因组(部分或全部长度)，因此在整个细菌群落中对耐药相关基因具有极大的检测能力。2017年，一项研究证明，在单微生物和多微生物样本中，经mNGS检测，可分别预测94.1%和76.5%的骨和关节感染病原体正确的抗生素敏感性[30]。同时mNGS在HIV耐药基因的检测和分型方面具有明显的优势[31]。

5 结语

mNGS在泛病原体检测试验中的潜力已在许多研究和临床背景中得到证实，其可以在不需要患者感染信息的情况下检测不常见和协同感染病原体，在耐药性预测方面具有优势，为危重患者或免疫缺陷患者难以诊断的感染提供新的诊断线索。随着测序成本的持续降低，以及诊断和信息学的自动化程度越来越高，更多的大中型实验室可能会实施mNGS，因为与一代测序替代方法相比，其成本更具竞争力，而且这些方法将成为标准化方法，甚至超越使用探针或特异性PCR扩增子的16S扩增方法[32]。对于mNGS的临床应用，各种样品类型的方法将会有更多的标准化和改进，包括如何解释和量化样品中复杂微生物群(如呼吸菌群、尿液菌群)中的病原体。此外，人们很可能看到这些测试转化为精确的医学诊断，整合病原体、微生物组和宿主转录组研究[33]，以更好地定义疾病状态。虽然在样品处理、工作流程建立、分析管道、法规要求和结果解释等方面还存在缺陷，然而更有效的工作流程、更低的检测成本、更短的实验室周转时间以及简化的解释标准促使mNGS将被临床医师、微生物诊断专家和患者广泛接受。因此，随着测序技术的进一步发展，以及更多的实践经验和评估，在未来5～10年，尽管mNGS不太可能完全取代传统的病原体鉴定和AST方法，但mNGS仍然有着巨大的潜力，并随着时间的推移不断改进，为感染性疾病提供更强的诊断能力。