MMP-2在眼组织中的表达与检测

蒋润 周激波

基质金属蛋白酶（Matrix metalloproteinase proteins，MMPs）是一类锌依赖的肽链内切酶，可存在于多种器官及系统中。根据其底物、自身结构及细胞定位可将MMPs分为胶原蛋白酶、明胶酶、间质溶解素、膜型金属蛋白酶以及基质溶解素这几种类型[1，2]。

MMP-2是MMPs家族中的第二个成员，为IV型胶原酶，又称明胶酶A。人类MMP-2基因编码分子量约72 kDa的酶原，经水解后活化为65 kDa的活性形式，活化后可与多种胶原底物相结合。与MMPs的其他成员一样，MMP-2在组织重塑、胚胎发育、伤口愈合、血管生成和炎症等生理方面起着重要的作用[3]。

MMP-2 的异常表达近年来被证明与多种疾病的发生发展有关，例如肺癌[4]、消化道肿瘤[5]、心肌梗死[6]等。MMP-2在许多眼科疾病中也起着重要作用，例如高度近视、圆锥角膜、青光眼、年龄相关性黄斑变性、脉络膜新生血管等。因此MMP-2在眼内的表达和检测成为研究眼疾病发生机制的重要环节[7，8]。现笔者对此方面的研究进行总结。

1 MMP-2在泪液和房水中的检测

泪液作为人眼中可无创获得的检测样本，能从健康人身上获取以作为阴性对照，对研究有很好的参考价值。2001年，英国科学家Smith与其研究团队从健康受试者和患有各种活动性眼病的类风湿关节炎患者的泪液中获得实验样品，通过酶谱法观察所有样品的MMP，发现活动性眼病患者的泪液中主要累积了MMP-2和MMP-9，比较样品中明胶酶酶谱活性特征，推断出这些MMP主要来源于粒细胞，泪液中MMP的积聚并非活动性溃疡性角膜炎患者独有；可在相关特应性疾病的患者身上检测到酶，如圆锥角膜、疱疹性眼病以及全身和非系统性干眼病[9]。2012 年，澳大利亚科学家Balasubramanian团队取正常人群和圆锥角膜交联手术后患者泪液进行MMP-2蛋白组学研究发现，普通人群为（37.1±4.8）FIU/mg，圆锥角膜患者约为（52.0±8.2）FIU/mg，两者差异虽无统计学意义，但从数值上来看，圆锥角膜患者的MMP-2含量更高[10]。

动物实验也不乏泪液MMP-2的检测。2013年，澳大利亚Andrea Petznick团队研究在角膜上皮创伤后泪液成分的变化，对18只实验室短毛猫随机选择的眼睛进行角膜上皮清创术，在基线和各愈合阶段收集眼泪，将正常眼用作对照，使用明胶酶谱法分析泪液MMP活性，免疫组化法评估MMP在眼组织中表达，该实验显示在上皮迁移和伤口闭合期间角膜中MMP-2表达增加，在角膜愈合过程中，泪腺MMP-2的免疫染色升高，而睑板腺的变化很小或没有变化。结膜相关淋巴组织显示弱MMP-2染色[11]。

房水中也检测到MMP-2的存在。2014年，JIA团队分别收集了近视和白内障患者的房水，通过LuminexxMAP技术分析了房水中MMPs和基质金属蛋白酶组织抑制剂（Tissue inhibitors of matrix metalloproteinases，TIMPs）水平，并分析其水平和眼轴长度（Axial，AL）之间的关系，首次在人类房水中检测到MMP-2、MMP-3、TIMP-1、TIMP-2和TIMP-3，且与AL呈正相关[12]。2018年，王理论团队选取110例确诊并接受治疗的原发性青光眼患者与68例原发性白内障患者的房水，采用酶联免疫法检测其中MMP2，对比发现青光眼患者房水中的MMP-2含量增多[13]。

由于在临床中很难获取正常人群的房水，通常选用接受透明晶状体置换术或白内障手术的患者的房水作为正常对照，房水中蛋白含量较少，具有一定的局限性。而在动物实验中，可以取材到眼部组织，但又因为动物眼球较小，对动物眼房水的测定至今仍较少。

2 MMP-2在角膜与巩膜中的检测

MMP-2在角膜中的研究已有二十多年的历史。正常人类角膜主要来源为捐献，病理角膜来源于角膜移植术。

1992 年，美国M.ElizabethFini团队利用免疫组化的方法从捐献的正常角膜组织和圆锥角膜中，证明提取出的是中性明胶酶MMP-2 和MMP-9 的促激活形式和活化形式。但是正常和圆锥角膜在可提取的中性明胶酶的量或亚型没有显示出统计学差异，也没有显示它们在培养中合成的量或亚型[14]。1998年，Zhou团队在检测中也得到类似结论[15]。而2000 年，Smith团队通过酶谱法分析来自正常和圆锥角膜的角膜细胞培养物分泌的MMP-2 活性谱，发现从培养的早期圆锥角膜的角膜细胞获得的蛋白质比从培养正常角膜角膜细胞获得的蛋白质更容易产生MMP-2的活化酶，即MMP-2活性增加[16]。2001年，谢立信团队也进行了正常角膜和圆锥角膜的免疫组化检测，发现MMP-2分布于角膜上皮、基质与内皮中，主要存在于细胞内或细胞外、基质纤维板层之间，且圆锥角膜中MMP-2含量明显增多[17]。其他疾病角膜中MMP-2含量也有研究，2016年，Alessandra Micera团队收集了40例青光眼患者和23例捐献者的角膜组织，通过蛋白质印迹、酶谱和聚合酶链反应证实MMP-2、MMP-7、TGFb-1和VEGF的表达异常，但在青光眼亚型之间未检测到蛋白质表达的差异[18]。

研究者在多种动物实验中检测角膜与巩膜中的MMP-2，例如鸡、兔子、豚鼠[19-21]等。其中MMP-2在近视中的作用得到了广泛的研究。2017年，Xi团队构建高度近视散光小鸡模型，检测角膜与巩膜的5个区域的MMP-2的mRNA检测，结果发现高度近视散光小鸡的角膜与巩膜上MMP-2的mRNA有更高的表达[20]。2018 年，Zhou团队构建MMP-2过表达小鼠，发现4周后巩膜MMP-2上调的小鼠在正常视觉环境中有明显的近视，相反，成纤维细胞特异性MMP-2缺失的小鼠的形觉剥夺性近视发展减弱27%，证明MMP-2在近视形成过程中起重要的作用[22]。2019年，Jiang团队构建房角关闭模型的兔子，通过免疫荧光、定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）和酶联免疫吸附试验（Enzyme linked immunosorbert assay，ELISA），评价实验组与对照组兔子的角膜巩膜连接处金属蛋白酶MMP-2，发现MMP-2染色在小梁网和虹膜中弥漫，MMP-2的免疫荧光信号在房角关闭后1个月内强烈，随后变弱[19]。

3 MMP-2在晶状体中的检测

目前，MMP-2与晶状体的研究集中在后发性白内障方面，但由于目前后发性白内障的治疗方式以YAG激光为主，所以人眼后发性白内障组织样本较难获取，目前MMP-2与后发性白内障的研究多在动物实验中进行。2008年Li团队测量MMP-2 在白内障手术前后的不同表达情况，以探讨MMP-2在后囊膜混浊中的可能作用。他们在6只人类捐献眼中进行假性白内障手术，利用免疫组化染色研究前囊膜破裂后人晶状体上皮细胞（Lens epithelialcells，LEC）的MMP-2的表达，并在术后多个时间点通过酶联免疫吸附测定法测定总MMP-2的蛋白表达，发现MMP-2蛋白表达随时间增加，在30 d达到最大水平，从而证实MMP-2的改变对后囊膜混浊有影响[23]。在动物实验中，也得出了相同的实验结果。2007 年，任孝伟团队对兔子进行白内障手术，利用免疫组化检测MMP-2蛋白以及zymography法检测MMP-2活性，发现正常兔晶状体囊膜中检测出MMP-2，而术后实验组MMP-2含量及活性较对照组增强[24]。

4 MMP-2在玻璃体中的检测

2000年，Vaughan-Thomas团队研究对人眼玻璃体的老化是否伴随着组织内降解酶的升高。通过酶谱法检测供体的玻璃体内MMP-2 含量，结果未显示MMP-2 含量与年龄有关[25]。

2014年，Zhuang团队选择了26例接受玻璃体切除术治疗黄斑视网膜劈裂或黄斑裂孔的高度近视（High myopia，HM）患者与26 例特发性黄斑裂孔或黄斑视网膜前膜非高度近视患者，在玻璃体切除术中获得玻璃体样品，通过酶联免疫吸附测定法测量玻璃体中MMP-2 的水平，通过荧光法测定MMP活性，结果显示HM患者玻璃体中MMP-2水平[（32.40±14.90）ng/ml]明显高于对照组[（21.42±6.74）ng/ml，P＜0.01]，同时，HM患者玻璃体样品中的MMP活性也明显升高[26]。随后，2017 年，樊莹团队从25 例HM与30例非高度近视进行玻璃体切除术的患者获取玻璃体样本，利用ELISA测量玻璃体内MMP-2的浓度，得到了相同的结论[27]。

其他眼科疾病对玻璃体中MMP-2 含量与活性也有研究。2017年，SonikaRathi团队对早产儿视网膜病变进行研究，纳入30例早产儿视网膜病变患儿以及30例先天性白内障患儿，术中获取玻璃体样本，通过蛋白质印迹和酶谱法对玻璃体内巨噬细胞/小胶质细胞进行检测，发现活化的MMP-9和（或）MMP-2水平较高，表明其在疾病发病机制中有潜在作用[28]。

动物实验中，2010年，德国科学家Florian Hofmaier团队构建自发性葡萄炎模型的马，以健康的马作为对照组，使用Western印迹定量分析MMP-2和MMP-9表达，用酶谱法检查酶活性，结果发现在自发性葡萄炎组的玻璃体中MMP-2表达减少，活性减少，但MMP-9 表达和活性增加，这些变化反映了自发性葡萄膜炎中MMPs的变化[29]。

5 MMP-2在后极部的检测

由于人类眼部取材的局限性，难以获得眼球后极部的组织，MMP-2在人类眼球后极部的检测较为少见。

2008 年，顾永昊团队就增殖性糖尿病视网膜病变、增殖性玻璃体视网膜疾病和急性视网膜坏死患者视网膜中MMP的表达情况，术后获取视网膜组织，以供体眼视网膜组织作为正常对照，冷冻切片后进行免疫组织化学染色，发现3个疾病组的MMP-2表达增强，故MMP-2可能在病变中起重要作用[30]。

MMP-2在动物眼睛后极部的研究十分多见，其中大鼠和小鼠是最常见的研究对象。2000年，Anders Kvanta团队将诱导脉络膜新生血管形成的大鼠分为激光治疗组与未治疗组，通过原位杂交技术分析MMP-2 mRNA在疾病不同时期视网膜和脉络膜的表达。与未治疗组相比，激光治疗组的眼睛中，MMP-2 mRNA表达明显增加并且主要位于巨噬细胞和视网膜色素上皮细胞，且侵入脉络膜、视网膜下间隙和内层视网膜，这种增加在第10天达到峰值，之后检测到下降。该现象支持MMP-2 在年龄相关性黄斑变性中脉络膜新生血管发展中的作用[31]。与之类似，2017 年，邹俊团队构建高度近视脉络膜新生血管的豚鼠模型，通过免疫组化与PCR对激光组与对照组眼睛中视网膜的MMP-2以及MMP-2 mRNA进行检测，实验结果同样支持MMP-2与高度近视脉络膜新生血管形成密切相关[32]。

除脉络膜新生血管以外，糖尿病视网膜病变也与MMP-2的异常表达相关。2007年Brahim Chaqour团队将高血糖致视网膜病变的大鼠与对照组的大鼠眼睛取出，解剖视网膜，通过原位酶谱法发现实验组大鼠的血管内皮细胞活性较弱，MMP-2活性较低[33]。

6 MMP-2在眼科其他疾病组织中的表达

MMP-2 在正常组织中的异常表达与眼部组织异常密不可分。而眼科疾病如眼母细胞瘤、眼黑色素瘤、翼状胬肉以及其他眼部新生物的发生发展，都与MMP-2 的表达有关[34-36]。

2011 年，龙华团队应用免疫组织化学SP法和HMIAS-2000型全自动医学彩色图像分析检测50例眼母细胞瘤组织中MMP-2表达，结果发现组织切片中MMP-2阳性表达38例，占76%；有视神经浸润的肿瘤MMP-2的表达水平明显高于无视神经浸润的肿瘤，处于眼外期的肿瘤MMP-2的表达水平明显高于眼内期和青光眼期的肿瘤，提示MMP-2的表达水平与肿瘤浸润、发展有关系[34]。2017年，Wang团队通过原位杂交技术和免疫组化检测6份正常脉络膜组织和18份脉络膜黑色素瘤组织MMP-2的表达，发现与正常脉络膜组织相比，脉络膜黑色素瘤组织中MMP-2 mRNA水平增加，同时，MMP-2的蛋白水平也较高，支持MMP-2的较高表达与脉络膜黑色素瘤进展呈正相关的观点[35]。2009年，Yang团队采用RT-PCR和酶谱法，检测5例正常结膜组织与15例翼状胬肉组织和其培养的翼状胬肉成纤维细胞观察MMP-2 mRNA的表达和活性，结果发现翼状胬肉组织和成纤维细胞中MMP-2的表达高于正常组织和成纤维细胞，且与翼状胬肉的进展程度密切相关[36]。

7 MMP-2的作用机制

MMPs能降解除多糖以外的全部细胞外基质（Extracellular matrix，ECM）成分，参与分解多种细胞外基质和降解基底膜的生理和病理过程[37]。其中MMP-2主要在组织重塑、伤口愈合、血管生成和炎症等方面起着重要作用[3]。MMP-2 的检测技术已经十分成熟，在疾病组织中的表达表现出了显著的异常，但MMP-2在疾病发生发展中的具体机制尚未明确。

在机体遭遇创伤时，大量炎性细胞聚集，释放以TNF-α（Tumor necrosis factor-α，TNF-α）和IL-6（Interleukin-6，IL-6）为主的早期炎性介质，启动全身炎性反应。增高的TNF-α和IL-6等炎性介质能够促进MMP-2的表达，而过表达的MMP-2正是导致疾病的原因。在角膜疾病中，IL-6介导的MMP-2显著上调，致使组织不断坏死被降解，导致疾病发生[38]；在眼肿瘤中，这一系列炎症反应也有重要作用，过表达的MMP-2降解ECM，ECM的降解形成局部溶解区，构成肿瘤细胞的转运通道，直接导致了肿瘤转移的启动，因此在侵袭性强的肿瘤中，MMP-2往往呈现高表达[39]。

蛋白质直接执行生物功能，其表达与浓度也直接关系着生理及病理过程的发展。在近视的基础研究中发现MMP-2 在眼组织中的浓度直接影响了巩膜重塑，与疾病发展有密切关系。多项形觉剥夺导致近视的基础研究发现，在巩膜组织中存在MMP-2的酶原形式，而形觉剥夺这个过程打破了原有的酶原活化平衡，MMP-2的活化形式在巩膜赤道部及后极部的浓度明显升高，导致ECM大量降解，最终使后极部纤维层变薄，眼球前后径方向拉伸[40-42]。mRNA水平也充分说明了这一过程，在形觉剥夺的过程中，MMP-2的mRNA表达上升[43，44]。在负透镜诱导的近视模型的研究中[45]，也发现了相同的变化过程。这是MMP-2在近视形成过程中的变化。而在角膜疾病、后发性白内障以及其他疾病中，MMP-2的酶原活化平衡被打破，从而导致疾病发生也是目前研究的主要机制之一[24，46]。

总之，MMP-2 作为MMPs家族中的第二个成员，在眼部正常的生理过程和异常的病理生理过程都有着不可或缺的作用。MMP-2在眼内检测的技术也较为成熟。但MMP-2在疾病过程中的具体机制与信号通路尚不明确，是今后研究的重要方向。

利益冲突申明本研究无任何利益冲突

作者贡献声明蒋润：参与选题、设计；撰写论文；根据编辑部的修改意见进行修改。周激波：参与选题、设计；根据编辑部的修改意见进行核修