志贺菌耐药基因及其检测方法

周潜 韩燕 刘经纬 尹跃平

中国医学科学院北京协和医学院皮肤病医院 中国疾病预防控制中心性病控制中心，南京210042

志贺菌（Shigella）于1898年由Kiyoshi Shiga发现并命名，是细菌性痢疾的病原体[1]。根据菌体抗原的结构不同分为4个血清群：痢疾志贺菌（S.dysenteriae）、福氏志贺菌（S.flexneri）、鲍氏志贺菌（S.boydii）和宋内志贺菌（S.sonnei）[2]。目前已发现志贺菌对包括磺胺类、四环素类、链霉素以及喹诺酮类等多种抗菌药物产生耐药[1]。志贺菌耐药机制与药物作用靶位的改变、染色体编码的外排系统蛋白表达增强和质粒介导耐药基因的表达有关[3]。2019年，WHO建议将环丙沙星作为治疗志贺菌感染的一线药物，阿奇霉素、头孢克肟和头孢曲松作为二线治疗药物[4]。本文选取喹诺酮类、大环内酯类与β-内酰胺类三类抗菌药物，综述了志贺菌耐药基因及其检测方法的研究进展和应用。

一、志贺菌耐药基因

1.喹诺酮类耐药基因

志贺菌耐喹诺酮类药物的机制主要包括染色体介导的药物作用靶位基因的改变与质粒介导的喹诺酮类耐药基因。染色体介导的氟喹诺酮类抗菌药物的耐药主要是编码DNA回旋酶和拓扑异构酶Ⅳ的基因发生突变导致，DNA回旋酶由gyrA和gyrB基因编码，拓扑异构酶Ⅳ由parC和parE基因编码[5]。突变最常发生在gyrA基因起始处附近Ala67和Gln107之间的区域，即喹诺酮类药物耐药决定区（QRDR），以gyrA基因上的Ser83、Asp87和His211突变最为常见[6]，并常与parC上的Ser80突变共同发生，在parC和gyrA区域发生多个突变能显著降低志贺菌对喹诺酮类药物的敏感性[7]。

质粒介导的喹诺酮类抗性区基因（PMQR），即qnr基因分离物[qnrA、qnrB、qnrS、aac（6’）-Ⅰb-cr]可借助如整合子或插入序列共同区等可移动遗传元件，通过接合或转化的方式，在志贺菌与其他肠杆菌科细菌之间传播[8]。aac（6’）-Ⅰb-cr和qnrS基因分别于1998年和2002年首次在福氏志贺菌2a型和1a型中发现[9]。Qnr蛋白能直接与DNA结合，减少回旋酶与DNA的结合，并保护拓扑异构酶Ⅳ免受喹诺酮的侵害，从而逆转喹诺酮类抑制DNA回旋酶的能力，同时Qnr家族蛋白可以提高细菌对喹诺酮类药物的耐药突变预防浓度（MPC）值，从而提高耐药突变的发生率。aac（6’）-Ⅰb-cr基因编码与喹诺酮活性降低相关的氨基糖苷乙酰转移酶，这种双功能酶能乙酰化环丙沙星、诺氟沙星和其他喹诺酮类药物，但左氧氟沙星不受这种乙酰转移酶的影响[8]。除此以外，在志贺菌中也发现了mdfA、acrA和acrB等外排泵编码基因调节的喹诺酮类药物耐药性[10]。

2.大环内酯类耐药基因

大环内酯类药物通过阻断50s核糖体中肽酰转移酶的活性，抑制细菌蛋白质合成发挥抑菌作用。以往的研究认为志贺菌对大环内酯类药物耐药主要原因为药物作用靶位的改变，如编码L22核糖体蛋白的rplV与编码L4核糖体蛋白的rplD和rrlH基因发生点状突变；以及由ompA、ompW、mefA和msrA等外排泵介导的耐药性。近年的研究发现质粒介导的阿奇霉素耐药基因同样发挥重要的作用，包括mph、erm和ere基因[11-12]。mph基因编码的磷酸转移酶可使脱氧二甲胺己糖C-2’位置发生磷酸化而失活，与阿奇霉素耐药高度相关，对阿奇霉素高度耐药（MIC>256 μg/mL）的志贺菌中均发现携带有mphA基因[13]。根据对mphA相关质粒的研究，志贺菌中mphA耐药基因的获得主要来源于大肠杆菌质粒的传播[14]。法国的研究筛查到携带p2246-CTXM质粒的阿奇霉素耐药志贺菌上带有IS26-mphA-mrx-mphR（A）-IS6100基因盒[12]。erm基因是红霉素甲基化酶基因，使核糖体23S rRNA上特定位点的腺嘌呤甲基化以阻止红霉素结合，在以色列发现携带ermB基因的2a型福氏志贺菌菌株表现出对阿奇霉素低敏[15]。

男男性行为者（MSM）人群中发现的志贺菌表现出对阿奇霉素的敏感性降低，并筛查出多种携带大环内酯类抗性基因的质粒，Darton等[16]研究发现在MSM中暴发的宋内志贺菌和3a型福氏志贺菌中存在具有显著的DNA同源性的IncFⅠ和IncFⅡ质粒，上有erm基因，该基因通过编码rRNA甲基化酶进行靶位修饰使志贺菌产生耐药性。英国的一项横断面研究对MSM人群中暴发的3a型福氏志贺菌进行全基因组测序，发现了携带mphA和ermB的质粒pKSR100，表现为对大环内酯类抗菌药物的高水平耐药性[17]，该质粒也被证实存在于2a型福氏志贺菌与宋氏志贺菌中[18]。

3.β-内酰胺类耐药基因

志贺菌耐β-内酰胺类抗菌药物的重要机制是质粒中的含有超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）基因与AmpC酶基因。ESBLs属于Ambler分类A类，Bush分类的2be亚群，对β-内酰胺类抗菌药物具有广泛水解活性。2004年，首次在孟加拉国发现了产ESBLs的志贺菌[19]。迄今为止，已有多个国家和地区的研究发现志贺菌携带不同类型的ESBLs基因，包括blaTEM、blaSHV和blaCTX-M基因[20-21]，其中CTX-M型ESBLs与 耐 药性的水平传播最为相关，CTX-M-15对哌拉西林、苄青霉素、头孢曲松和头孢噻肟具有很高的催化效率[22-23]。在来自中国患者的福氏志贺菌分离株中发现两个偶联质粒IncHI2和IncF，携带有blaCTX-M-123的ESBLs基因，该基因由CTX-M-9和CTX-M-1组成，可在福氏志贺菌中水平传播[24]。SHV基因型ESBLs是广谱酶SHV-1的编码基因核苷酸突变形成的酶，如SHV-2相比SHV-1发生Gly238→Ser突变，具有超广谱特性[25]。近年还发现有携带SHV-12等SHV型超广谱酶的志贺菌流行[26]。TEM型内酰胺酶根据其水解底物谱，可分为4类包括广谱B内酰胺酶、ESBLs、耐酶抑制剂β-内酰胺酶和CMT。志贺菌中发现由质粒介导的TEM-1基因发生水平转移，引起宋氏志贺菌对氨苄西林的耐药[27]。

AmpC酶是由染色体或质粒介导产生的一类β-内酰胺酶，属于Ambler分类C类，Bush分类的1群，为作用于头孢菌素且不被克拉维酸抑制的β-内酰胺酶。Taneja等[28]研究发现，有20%对头孢曲松或头孢吡肟具有耐药性的福氏志贺菌产AmpC酶。在中国台湾的细菌性痢疾流行期间，也发现耐头孢曲松的宋内志贺菌分离株中存在CMY-2型AmpC β-内酰胺酶质粒[29]。

二、志贺菌耐药基因的检测方法

1.常规PCR法

PCR法是将志贺菌耐药基因作为靶基因，针对基因两端设计特异性引物进行扩增，进行琼脂糖电泳或序列测定以检测靶基因是否存在或发生突变的方法。PCR法在耐药基因检测方面具有操作简便、成本低等特点。1994年，Rahman等[30]根据大肠埃希菌gyrA基因设计特异性引物，通过结合PCR法与一代DNA测序技术首次发现了喹诺酮耐药志贺菌gyrA基因上的Ser83突变。之后，更多研究者使用PCR法鉴定出志贺菌耐药基因，Ezernitchi等[15]使用PCR法对以色列2014—2016年收集的志贺菌进行耐药基因检测，其中对阿奇霉素低敏感的志贺菌均带有mphA和ermB基因。毛联钢等[31]使用PCR法对宁波地区肠道感染志贺菌喹诺酮类药物耐药基因进行检测，发现环丙沙星耐药菌中97.59%的分离株带有Ser83、Asp87和Ser80突变。

2.多重PCR法

多重PCR是在传统PCR基础上发展出的一种检测方法，其在同一PCR反应体系里加入2对以上引物，从而可以同时扩增出多个核酸片段的PCR反应[32]。对于志贺菌耐药基因，可同时设计针对多个基因的特异性引物，选择合适的退火温度，实现对多个基因的克隆和鉴定。王倩等[33]使用多重PCR方法，在退火温度为57.5℃的条件下，可同时扩增出gyrA、parC和毒力致病性基因ipaH用于下一步测序与鉴定。Zhang等[34]使用多重PCR的方法对北京、成都和乌鲁木齐等地收集的志贺菌菌株β-内酰胺酶类抗菌药物耐药性进行检测，发现可同时对多种ESBLs基因进行检测。多重PCR较传统PCR方法耗时较短，但由于引物之间的相互作用，对多重PCR的扩增条件要求较高，需要反复优化调整复性条件和引物浓度以增加扩增效率。

3.实时荧光定量PCR法（qPCR）

qPCR是在PCR体系中加入荧光基团，扩增过程中通过荧光信号累积对PCR进程进行实时检测的方法。根据RT-qPCR的化学发光原理可分为探针类方法（TaqMan探针和分子信标）和非探针类方法（SYBR GreenⅠ等荧光染料）。针对志贺菌的QRDR区gyrA和parC突变，可设计特异性TaqMan MGB探针对突变碱基进行检测。Kim等[35]开发了针对gyrA基因Ser83和Asp87突变与parC基因Ser80和Agr87突变的TaqMan探针，使用qPCR法可检测是否存在碱基突变，qPCR法的检测结果与测序结果相同。对于质粒介导的耐药基因，qPCR法可定量检测耐药基因及转录水平。Zhang等[11]对来自中国的392株志贺菌分离株通过qPCR法进行耐药基因分析，检测到55%（44/80）的阿奇霉素低敏志贺菌具有mphA基因，未发现与阿奇霉素耐药性相关的外膜蛋白基因ompA和ompW的过表达。相较常规PCR，qPCR法具有对待测基因进行快速及精确相对定量检测的特点，并能通过定量mRNA来分析待测基因的表达水平。

4.基因芯片法

基因芯片法又称DNA微阵列杂交法，主要基于固体基质（载玻片或硅薄膜）上的二维阵列以高通量地定性或定量测定DNA分子，其探针由数kb或几十个特定核苷酸构成，DNA微阵列技术现主要应用分析DNA突变及多态性、检测基因表达差异、发现新的致病基因等多个研究领域[36]。Taitt等[37]开发了ARDM v.2 DNA芯片，该芯片可识别针对17种抗菌药物的236个耐药性基因，每个基因在芯片上包含4或5对重复探针，将芯片与生物素化的DNA片段杂交后，使用辣根过氧化物酶标记链霉亲和素来产生信号。Taitt等[38]通过该芯片对多种腹泻致病菌的耐药基因进行检测，在2株志贺菌中发现了质粒介导的qnrS基因，同时检测到头孢耐药志贺菌株中的blaCTX-M-9和blaCTX-M-1基因。

5.全基因组测序法（WGS）

WGS可以快速全面地找出个体基因组上的所有突变，在定义耐药基因型和预测耐药表型具有很高的灵敏度和特异性。通过WGS进行生物信息学分析构建进化树，可对细菌基因组学与传播模式进行精确研究。通过WGS识别耐药基因常采用二代测序方法，形成短读序列片段以后，使用定制算法将片段映射到参考序列以确定是否存在耐药基因，耐药基因的参考序列可在CARD或NCBI等数据库中获得[39]。Baker等[17]通过全基因组测序的方法，对福氏志贺菌3a型进行谱系与耐药基因研究，所有的分离株均携带一个共同的多药耐药元件（SRL-MDRE），而MSM相关谱系中发现了额外的耐药相关可移动遗传元件，编码了对其他抗菌药物的耐药性。Mook等[40]对英国发现的志贺菌分离株183660进行WGS后，发现在p183660质粒上存在超广谱β-内酰胺酶（ESBL）基因TEM-1和CTX-M，使该分离株获得对β-内酰胺类抗菌药物的高水平耐药性。

三、展望

志贺菌对各种抗菌药物的耐药性不断增加，对其耐药基因与突变位点的研究与检测尤为重要，根据目前已知的耐药基因对志贺菌进行检测，有助于对志贺菌感染的有效治疗提供依据。在耐药基因检测方面，可根据实验室条件选择PCR法、DNA微阵列技术和全基因组测序法，在检测志贺菌感染同时进行耐药基因检测。在未来，随着检测技术的不断更新，有望研究出更多低成本、操作简便的耐药基因检测技术，进一步实现对志贺菌的有效防控。

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