外源高表达miR-133b抑制骨肉瘤的增殖与转移

陈鹏业，孙建伟，刘跃贞，陆丽峰

骨肉瘤(OS)是一种侵袭性骨肿瘤，其特征主要是恶性类骨质生成和成骨细胞分化。治疗方式以手术切除为主，但多数OS患者的预后不良。随着顺铂、多柔比星、异环磷酰胺以及甲氨蝶呤在OS的新辅助化疗中的应用，患者的5年生存率已增加至50%～80%[1]。但是，OS发病机制和病因仍未明确阐明。MicroRNA(miRNA或miR)是一种长度为22～24个核苷酸的短链保守非编码RNA，被认为是一种应用前途极广的恶性肿瘤诊断和预后工具。miRNA通过与互补靶mRNA结合，导致mRNA降解或阻止mRNA被翻译。故miRNA在转录后水平调节靶基因的表达。miRNA的过表达通常导致靶基因的死亡表达。有证据显示98种miRNA位于脆弱位点和癌症基因组区域，表明miRNA与肿瘤发生、进展密切相关[2]。通过介导癌基因或肿瘤抑制因子的表达，miRNA在肿瘤生长、进展、转移和耐药性中发挥关键作用[3]。

miR-133b是miR-133家族的成员，被称为肌肉特异性miRNA，介导成肌细胞增殖和分化。最近，miR-133b也在肌源性肉瘤中被发现。此外，miR-133b在胃癌、结直肠癌、膀胱癌、前列腺癌和肺癌中的表达降低，表明miR-133b在肿瘤发生和癌症进展中起重要作用[3-5]。然而，miR-133b在骨肉瘤中的表达和功能尚不清楚。本研究采用MTT、划痕实验及Taswell侵袭实验检测miR-133b在骨肉瘤细胞中的生物学行为，现总结报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料 人骨肉瘤qRT-PCR检测人骨肉瘤细胞系(MG-63)细胞与人正常成骨细胞系(hFOB)购置于美国ATCC公司，Lipofectamine 2000、miR-133b mimics、scramble、MTT粉、Transwell小室购于美国Invitrogen公司。

1.2 qRT-PCR检测miR-133b的表达 采用RNA抽提试剂盒抽提MG-63与hFOB细胞中的总RNA，借助于逆转录相关设备，进行cDNA的合成，并将其存储在-70 ℃环境中，考虑到实际的研究需求以及临床表征，对PCR扩增体系进行必要的优化调整，通过必要的设备、试剂增加，提升扩增反应的实际效果。同时出于整个研究的需要，对循环的温度、时间及循环次数进行严格控制，通过这种方式，提升检测结果表达的有效性。

1.3 MTT实验 按照相关临床指标，进行实验细胞的培育，在培育环节，需要将质粒依据转染的要求，进行系列化的操作，以保证实验的有效性，并在此基础上，逐步形成miR-133b mimics与scramble 2个组别。培育环节，分别将转染处理后获取的细胞接种到孔板中，培育周期保持在4 h，4 h后将孔板取出，加入适量的DMSO 150 μl，并进行低速振动，将振动过程中出现的波长数据进行详细、准确的记录和分析。为排除干扰因素的影响，连续进行3次实验。

1.4 划痕实验 细胞培养与分组同划痕实验。将细胞接种于6孔板中培养，待长至临近饱和，用PBS缓冲液将板中细胞洗涤2遍，用无菌10 μl Eppendorf Tip在细胞板上划痕。倒置显微镜下分别观察各组细胞0 h与48 h的划痕距离，并摄像。软件测量各孔细胞任意3个部位的不同划痕距离，计算各组伤口愈合率，取3组实验的平均值，并进行统计分析。

1.5 Transwell侵袭实验 在细胞培养环节，采取分组划痕实验的机制，通过在侵袭实验中增加一定浓度比重的基质胶，获取基质膜。在完成上述操作后，研究人员采取分层处理的方式，将100 μl稀释液放置于上层，在下层则加入适量的培养液，并将整个实验温度控制在37 ℃环境内，静置36 h，静置完成后，研究人员提取上层未迁移的细胞，进而必要的实验处理。使用光学显微镜等设备，进行观察和记录。

2 结 果

2.1 MG-63细胞中miR-133b的表达水平检测 qRT-PCR检测结果显示，MG-63细胞中miR-133b的表达水平为(0.418±0.032)，低于hFOB的表达水平(3.275±0.148)，差异有统计学意义(t=184.868，P<0.01)。

2.2 外源高表达miR-133b对人骨肉瘤MG-63细胞增殖的影响 MTT实验结果表明，人骨肉瘤细胞经过系统培育，其miR-133b mimics组别中，OD值数0.426～0.448，与scramble组别相比，数据差异较为明显，具有研究价值与意义(t=110.616，P<0.01)。表达miR-133b能抑制癌细胞的增殖。

2.3 外源高表达miR-133b对人骨肉瘤MG-63细胞迁移的影响 划痕实验结果显示，转染miR-133b mimics组48 h后伤口愈合率分别为(51.7±6.4)%，与scramble组(72.3±9.5)%相比，差异有统计学意义(t=17.621，P<0.01)。提示在人骨肉瘤MG-63细胞高表达miR-133b能抑制癌细胞的迁移。

2.4 外源高表达miR-133b对人骨肉瘤MG-63细胞侵袭的影响 Transwell实验结果显示，miR-133b mimics组穿过基质胶的人骨肉瘤MG-63细胞数量为(149±11)与scramble组(216±18)相比，差异有统计学意义(t=31.119，P<0.01)。提示在人骨肉瘤MG-63细胞高表达miR-133b能抑制癌细胞的侵袭。

3 讨 论

自20世纪70年代采用术前和术后化疗以来，部分OS患者的5年无生存率(EFS)已达到70%。然而，转移性OS患者的预后较差，5年EFS仍≤20%。据报道，miRNA有助于OS的发展和转移，并可能为治疗该疾病提供新的治疗靶点。

研究已证实，微小RNA可以作为致癌基因或肿瘤抑制基因来介导恶性肿瘤的生长、发育和进展。迄今为止，研究者已鉴定出OS中miRNA的表达谱。有研究发现，与正常人成骨细胞相比，在骨肉瘤细胞系中发现了26种差异表达的miRNA[6]。Maire等发现与正常人成骨细胞相比，从7个人骨肉瘤组织样本中鉴定出38个差异表达的miRNA[7]。Novello等发现包括miR-1，miR-133b和miR-378在内的12种miRNA在高级和低级OS中差异表达[8]。然而，这些研究很少共享差异表达的常见miRNA。此外，即使在同一项研究中，OS组织中的几种差异表达的miRNA也不能在骨肉瘤细胞系中持续表达。这表明在细胞系、组织或患者的来源之间的差异可能会影响骨肉瘤的miRNA表达谱。

有证据表明miR-133b在肌肉组织中特异性表达，在肌肉发育、心肌分化和心肌肥厚中起重要作用，通常被认为是肌肉特异性miRNA。最近的报道表明，miR-133b在其他生物学过程如神经元和脂肪分化中也起着至关重要的作用。此外，据报道称miR-133b在多种恶性肿瘤中对于细胞的自身的增殖、衰亡等生命周期有着最为直接的影响。相关研究充分表明，胃癌、直肠癌患者在发病后，其细胞内miR-133b指数明显下降[9]。出现这种情况的主要原因在于：miR-133b使得人体内细胞的外源表现较为特异，实现癌症细胞增殖、迁移的有效抑制，从而避免癌症转移，达到防范化解癌症风险的目的[10-11]。

为了评估miR-133b在骨肉瘤中的表达与生物学功能，研究首先通过qRT-PCR检测发现PDL1在人乳腺癌细胞中高表达，接下来通过转染miR-133b mimics来外源高表达人骨肉瘤MG-63细胞中miR-133b的表达[12-14]。从MTT实验结果来看，人骨肉瘤MG-63细胞在进行miR-133b的表达后，细胞自身的繁殖能力明显降低，依托划痕实验，在很大程度上，论证了这种内在联系。同时Transwell侵袭实验也表明miR-133b在表达后，癌细胞的活性受到有效控制，癌症得到有效应对。

综上所述，miR-133b在OS中表达下调，外源高表达miR-133b能抑制人骨肉瘤MG-63细胞的增殖与迁移侵袭，表明miR-133b可作为一个潜在的治疗靶点用于OS的治疗。