微量元素复合剂对嗜酸乳酸菌保存活力的影响

千慧燕，闵鹏飞，杨冰祎，贾立军*，刘德志

1.延边大学农学院动物医学系，吉林延吉 133000；2.吉林省磐石市富太镇畜牧服务站，吉林磐石132307

乳酸菌(LAB)是一类能够利用糖类进行代谢的革兰氏阳性细菌，其生存范围从土壤、植物覆盖到哺乳动物的口腔、胃肠道等[1]。经研究证明，乳酸菌的活用对动物健康有密切关系。乳酸菌不仅能够调节体内肠道正常菌群、保持微生态平衡、控制内毒素、抑制肠道内腐败菌生长繁殖，同时，乳酸菌通过发酵产生的有机酸、特殊酶系、胞外多糖、细菌素等营养物质，可刺激组织发育，从而对动物的营养状态、免疫反应等产生促进作用。并且，绝大多数乳酸菌具有抗菌活性，主要是源于其生长代谢过程中所分泌的一系列活性物质，诸如乳酸、胞外多糖、抗菌肽以及细菌素等[2]。所以乳酸菌具有非常良好的抗菌活性，同时也是其益生活力的重要指标之一。正常情况下的乳酸菌，活力极弱，这些益生菌只能在受到一定限制的环境中生存，一旦脱离生存条件，其自身就会遭到灭亡。所以只有经过特殊工艺保护的乳酸菌才能到达肠道。进入体内的乳酸菌，必须具有数量多、活力强，才能充分发挥生物功效。如何研制出高浓度且活力强的乳酸菌，成为了当今微生学家们追求的目标。

微量元素复合剂是经过加工和调节的矿物质，含有大量的微量元素。矿物来自自然界，是自然界中经过长时间的恶劣天气自然形成的岩石，以不同大小的颗粒形式存在于自然界中。由于乳酸菌的培养条件较好，而且对其生长和繁殖所需的微量元素的研究正在进行中，因此对有机微元素的研究很多，但过程成本较高，关于天然矿物微量元素的研究更少。本试验中使用了天然矿物质来优化营养条件和影响的观察来研究起初对乳酸菌的生长和繁殖、酸和碱的变化、细菌代谢物的温度和抗菌的效果。

1 材料和方法

1.1 菌种来源

乳酸杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌均从中科院微生物研究所购置，并在延边大学农学院微生物与免疫试验室保存。

1.2 培养基

MRS液体培养基、MRS固体培养基本实验室配制。

1.3 乳酸菌的培养

将获得的嗜酸乳杆菌材料与生理盐水配置成悬浊液，再用划线法接种到MRS琼脂平板上，在恒温培养箱培养，使用接种环从平板培养物上挑取某一单独菌落，移种至MRS液体试管中，配置5组，再挑出4组加入乳酸菌培养中所需的常量元素，在恒温培养箱培养。将大肠杆菌和金黄色葡萄球菌原液稀释至106cfu/mL，倒入平皿中，使其在底层上均匀摊布，作为菌层。

1.4 微量元素复合剂浓度对乳酸菌活性的影响

以浓度梯度法，将复合剂分别加入到含有常量元素的4组MRS液体试管中。设置复合剂浓度梯度分别为0.05%、0.1%、0.25%、0.5%。不含复合剂和常量元素的MRS液体试管设为空白对照组。先高压灭菌备用，再取乳酸菌悬液100 µL, 分别接种到MRS液体梯度试管中混匀,置37 ℃条件下厌氧培养48 h。使用平板计数法，采取MRS培养液接种到平板中培养，观察乳酸菌活性的浓度变化。

1.5 微量元素复合剂浓度对乳酸菌数量的影响

配合使用平板计数法：分别从取嗜酸乳菌MRS培养液样品中摇匀取样，在无菌环境下，用平板划线法接种到普通琼脂平板培养基中培养24 h，观察并记录平板培养基上菌落的数量。

1.6 微量元素复合剂浓度对乳酸菌形态的影响

采取MRS培养液，在洁净无脂的载玻片上涂直径1 cm左右的涂膜。使用革兰氏染色剂依次进行革兰氏染色，最后用高清晰显微镜观察活菌形态。

1.7 微量元素复合剂对乳酸菌菌液浑浊度变化的影响

取5 mL的菌液置于10 mL离心管中，经4 000 r/min，离心20 min。弃去上清液，用生理盐水洗涤。洗涤两次后，用紫外分光光度计在波长600 nm范围，测定该菌的吸光值，结合记录的数据分析比较乳酸菌活性变化。

1.8 微量元素复合剂对乳酸菌抑菌效果的影响

取制备大肠杆菌和金黄色葡萄球菌菌层的平皿和离心后的上清液，使用牛津杯法，用抑菌圈用尺测量抑菌圈大小。测试6种乳酸菌的代谢产物针对大肠杆菌，金黄色葡萄球菌的抑菌效果，分别测抑菌圈直径，取平均值，分析矿粉对嗜酸乳杆菌代谢产物抑菌效果的影响。

2 结果

2.1 细菌形态学观察

经高清晰显微镜观察，细菌接种于普通琼脂培养基上，培养后观察可见细菌生长良好，菌落呈表面光滑不透明的圆形乳白色白蜡状菌落，直径约4～6 mm。

2.2 微量元素复合剂浓度对乳酸菌活性的影响

实验结果表明，与空白对照组(即0%)对比,微量元素复合剂对乳酸菌的生长有促进作用。每一组加入复合剂的实验组乳酸菌数量都要比空白组多，并且和空白对照组相比活菌数量幅度稳定，死亡速度非常缓慢，仍然保持活性，当复合剂的浓度达到0.10%时，乳酸菌的增殖菌数最多，细菌最多数量为3.56×108，乳酸菌数量比较空白对照组多了0.8%。由此可见，浓度0.1%的微量元素复合剂最为适宜。

2.3 微量元素复合剂对细菌抑菌作用的影响

在金黄色葡萄球菌的抑菌实验数据中可知，微量元素复合剂浓度为0.05%和0.1%的抑菌圈直径与空白对照组的抑菌圈直径接近，其中浓度0.05%的乳酸菌代谢产物抑菌作用大于空白组。微量元素复合剂浓度0.1%的乳酸菌代谢产物的抑菌作用和空白对照组相似，浓度0.05%的乳酸菌代谢产物的抑菌作用均大于空白对照组。

在大肠肝菌的抑菌实验数据中可知，第一次乳酸菌抑菌圈直径中每一组浓度均比空白对照组大，在第二次测量中每一组抑菌圈直径都在10 mm左右。微量元素复合剂浓度0.05%和0.1%的乳酸菌代谢产物的抑菌圈直径平均数值比空白对照组大，浓度0.1%的乳酸菌代谢产物的抑菌作用均大于空白对照组。

3 讨论

微量元素作为微生物生长所必需，是构成细菌菌体的重要组成成分，主要起到调节微生物生长渗透压，维持增殖过程中所需酶的活性等作用。在地壳中自然存在的微量矿物质元素，作为生物成长中的营养元素，对身体维持生命起着重要作用。矿物质、微量元素为乳酸菌的生长和繁殖提供了必要的营养。乳酸菌是肠道菌群的主要组成部分，其代谢产物如细菌素可抑制肠道细菌中受损细菌的生长和繁殖，并对维持肠道微生物的平衡起着重要作用。代谢物乳酸细菌培养测试后的24 h内,结果表明,矿物质微量元素可以更好地改善代谢产物乳酸细菌的抗菌食品工业中,能够抑制有害细菌的生长和繁殖的食品,延长寿命。

本实验中，通过对实验结果的分析,适当浓度(即0.1 g/mL)的微量元素可以促进乳酸菌的生长和繁殖,延长其存活时间,并提高乳酸菌的抑菌效果在其他细菌和抑菌作用的持续时间增加。