甲型流感病毒血凝素糖基化的生物学效应

于海英，王 琨，孙艺学，丛彦龙*

(1.吉林大学 动物医学学院，吉林 长春 130062；2.长春大学 政策法规办公室，吉林 长春 130022)

许多重要的生命活动、疾病的发生不仅与蛋白的丰度有关，更重要的是受到蛋白的翻译后修饰调控。其中，糖基化即为蛋白的一种重要翻译后修饰，它不仅影响蛋白的折叠、定位和转运，而且可以改变蛋白的分泌、抗原性、生物活性、半衰期，以及蛋白与其他生物大分子之间的相互作用[1]。

甲型流感病毒(influenza A virus，IAV)的跨膜纤突蛋白——血凝素(hemagglutinin，HA)在核糖体中合成后转移至内质网中，在此HA依赖宿主的翻译机制，在糖基转移酶的作用下将“劫持”的细胞糖链以N-糖苷键形式连接到HA的N-连接糖基化基序(N-linked glycosylation sequon，NGS)——N-X-S/T-Y(X和Y是除P以外的任何氨基酸)[2]，从而实现自身蛋白的糖基化。当HA从内质网向高尔基体转运时，糖苷酶和甘露糖苷酶会对HA的糖链进行修剪和重塑等再加工。需要指出的是，HA的NGS并非都要进行糖基化修饰，具体是哪个(些)NGS会被糖基化，加载何种类型的糖链，以及糖链的加工程度，要取决于IAV感染的特定细胞[3]。

在空间结构上，HA蛋白是一个以非共价连接的同源三聚体，每个HA单体由胞外域、跨膜域和胞质尾区三部分组成，其中糖基化修饰只发生于HA胞外域的球状头部和茎区。对于不同亚型、甚至同一亚型的不同IAV毒株，位于它们HA球状头部的NGS的数量和位置可能存在显著性差异，而位于茎区的NGS相对保守，变异幅度较小[4]。此外，不同位置的糖链对HA蛋白的功能和病毒的生物学表型亦有不同的影响[5-6]。

1 糖基化修饰影响HA蛋白的折叠和转运

HA茎区糖链的作用主要是稳定HA蛋白的构象以促进其胞内转运，同时提高HA蛋白的折叠效率以促进三聚体的形成[3，7]。清除茎区的NGS会严重损害HA的定位、折叠和寡聚化，改变它的pH敏感性，致使其构象不稳。以H7N1亚型流感病毒为例，它的HA茎区至少要保留第12位或第28位的NGS才能保证HA的转运效率；如果同时缺失了这两个NGS，HA的转运能力和融合活性将显著下降。此外，某些重叠性的NGS，例如H2N2亚型流感病毒HA的第20～23位氨基酸残基NNST，还可以促进HA蛋白的正确折叠、胞内转运及其生物活性的发挥[7]。

2 HA糖基化对免疫应答的影响

HA糖链数量的增多，尤其是HA头部糖链数量的增加，是导致IAV出现抗原漂移的重要原因。糖链对HA抗原表位的遮蔽是IAV逃避宿主免疫监视的重要手段[3]。

2.1 HA糖基化影响病毒的固有免疫应答宿主的固有免疫系统通过模式识别受体(pattern recognition receptors，PRR)识别病原相关分子模式，以此区分自我分子与病原分子。PRR既可以分泌于血清和管腔分泌物中(如可溶性C型凝集素)，也可以位于细胞内或细胞表面(如膜相关C型凝集素)。可溶性C型凝集素主要有表面活性蛋白(surfactant protein D，SP-D)和甘露糖结合凝集素(mannose-binding lectin，MBL)。SP-D和MBL是流感病毒的天然抑制剂，因为它们具有一个或多个高度保守的糖识别结构域，能够结合HA头部糖链末端的甘露糖、岩藻糖或半乳糖衍生物，由此发挥一系列的抗病毒活性，包括抑制血凝、中和病毒、聚集病毒以及拮抗IAV介导的中性粒细胞功能障碍等[8]。而膜相关C型凝集素主要有巨噬细胞甘露糖受体(macrophage mannose receptor，MMR)、巨噬细胞半乳糖型凝集素(macrophage galactose-type lectin，MGL)和树突状细胞所特有的细胞间黏附分子-3结合非整合素(DC-specific intercellular adhesion molecule-3-grabbing non-integrin，DC-SIGN)。这些分子可以作为IAV吸附或进入Mφ和树突状细胞(dendritic cell，DC)的受体，介导IAV感染巨噬细胞(macrophage，Mφ)和DC，诱导Mφ和DC释放抗病毒因子和促炎性细胞因子，从而抑制病毒的早期复制，调节病毒感染后的炎症反应[7，9]。此外，固有免疫细胞对IAV的易感性与HA的糖基化程度有关。HA糖基化程度越高，IAV越容易感染小鼠Mφ，而糖基化程度较低的毒株的感染效率也会降低[7]。因此，了解凝集素与IAV之间的互作，可以为流感的治疗和免疫预防提供新的思路。

2.2 HA糖基化影响病毒的获得性免疫应答作为IAV变异频率最高的基因，HA对其头部氨基酸的变异具有高度的耐受性[4]。无论是氨基端替换，还是糖基化修饰，都主要集中于HA头部5个高度可变的免疫显性抗原表位[10-11]，这可以干扰甚至阻断抗体的中和作用。糖链对HA中和表位的遮蔽是IAV逃避免疫监视的重要手段。此外，HA糖基化还可以调节抗体的交叉反应和HA不同区域的体液免疫应答。例如，当在2009年H1N1亚型流感病毒的第130位添加糖链时，尽管该糖链遮蔽了HA的一个优势抗原表位，但是改造后的病毒诱导产生的抗体不仅可以与HA的多个抗原表位结合，而且交叉反应性也得到提高。EGGINK等[12]通过增加糖基化试图屏蔽HA的免疫优势抗原表位的研究发现，尽管HA头部的免疫应答受到抑制，但是该病毒仍然能够诱导产生靶向HA茎区的高滴度抗体，用其免疫的小鼠能够阻止其他HA茎区相同病毒的感染。此项研究表明，靶向HA茎区以诱导IAV的体液免疫应答具有重要的研究价值。

IAV的自然感染既可以诱导B细胞应答，又能够刺激T细胞反应。但T细胞主要针对IAV内部蛋白(如PA和NP)的保守表位产生应答，由此介导不同亚型毒株之间的交叉保护。虽然目前已知HA的CD4+和CD8+T细胞表位，并且发现HA糖基化的改变可以帮助IAV逃避T细胞的识别，但是关于HA糖基化如何调节T细胞的IAV应答仍知之甚少[7，13]。有研究显示，提高HA的糖基化程度可以干扰CD4+T细胞反应，表明糖链能够抑制T细胞接近糖肽-MHC复合物，从而降低T细胞的免疫应答。当去除HA的部分糖基化，可以暴露HA的T细胞抗原表位；但如果完全去除HA的糖基化，反而会导致某些T细胞抗原表位功能的丧失[7]。

3 HA糖基化影响HA的受体亲和性和病毒的适应性

如上所述，HA糖基化在病毒逃避获得性免疫中的作用方式是遮蔽或修饰HA头部5个高度可变的免疫显性抗原表位。然而，这些抗原表位主要位于HA的受体结合区(receptor-binding domain，RBD)附近。当糖链出现在RBD周边时，可能由于大体积糖链的空间位阻或静电排斥效应而影响HA与细胞表面唾液酸受体的亲和性[14]。这种影响与糖链和RBD之间的距离以及HA的糖基化程度有关。糖链距离RBD越近，HA的受体亲和性受到的影响越大。如果糖基化程度降低，尽管可以提高HA的受体亲和力，但是受体亲和的特异性也会随之降低。反之，当HA的糖基化程度增加，HA与受体之间的对接也将受到更大的限制。例如，额外增加糖链数量会损害H2N2亚型流感病毒HA的受体亲和性和融合活性，说明HA糖基化模式的改变会影响病毒的适应性，这同时也解释了至今尚未在人群中发现有HA糖基化增加的H2N2毒株的原因。除了H2亚型流感病毒，H1、H3、H5、H7和H9等亚型病毒的HA糖链也可以影响HA的受体亲和性及其特异性[7，15]。例如，H5N1病毒HA第158位和169位糖链与两种不同构象的HA受体α-2,3-唾液酸和α-2,6-唾液酸在结合偏好上有所不同。第169位NGS缺失的病毒偏嗜结合前者，而158位NGS缺失毒更易与后者结合。

基因变异是病毒适应环境的一种生存策略，然而，变异并不总是有利于病毒的生存。为了生存，病毒已经进化出了一种“分子耐受机制”，即通过同一基因或不同基因位点变异的叠加效应来弥补某些突变对病毒适应性造成的不利影响[16]。研究发现，IAV可以通过“上位突变(epistatic mutation)”这种代偿性的分子耐受机制来弥补或修复蛋白的功能，以保持病毒的适应性。例如，当HA头部RBD附近出现糖基化时，为了不影响HA的受体亲和性，病毒会通过替换RBD或者其他位置的氨基酸，使RBD不至于被糖链完全遮蔽，以此保持甚至提高HA的受体亲和性[6]。

在IAV的进化过程中，HA的NGS数量有逐渐增加的趋势，这被认为是IAV进化的一种选择优势。然而，HA不会不加节制地进行糖基化修饰，它必须考虑由此带来的适应性成本。HA糖基化修饰的前提是，需要在免疫逃逸和受体亲和性之间寻求一种最佳的平衡状态。当HA糖基化达到临界水平时，为了保持病毒的适应性，IAV可以通过转换NGS的位置，即某一位置NGS的消失伴随着另一位置NGS的出现，以此对自身糖基化程度设置一个适宜的阻力。这或许指征了IAV的另一个进化特征：在某种程度上，IAV能够规避过度糖基化。

4 小结与展望

综上，糖基化修饰不仅有利于HA蛋白的胞内转运和折叠，而且是IAV逃避免疫监视、调节HA受体亲和性的重要进化手段。糖基化程度升高虽然可能帮助病毒逃避体液免疫，但却提高了固有免疫对IAV的识别。所以，糖基化修饰也是一把双刃剑：既有利于宿主对IAV进行识别和清除，又是IAV逃避宿主免疫监视的工具；从另一个角度来讲也是如此，即尽管HA糖基化是IAV免疫逃逸的一种进化优势，但这种优势显然要以病毒的受体亲和性或其他适应性的改变作为代价。在进化过程中，为了保持良好的适应性，IAV必须保持适宜的HA糖基化水平，才能在免疫逃逸与受体亲和性之间达成功能上的协调。因此，IAV最佳的HA糖基化模式或许是“固有免疫-获得性免疫-病毒受体亲和性”等多方共同协调的结果。

当前，疫苗研制主要是基于遗传学和结构生物学来确定IAV的抗原性和免疫原性，而HA的糖基化模式往往被忽略。需要关注的是，IAV的抗原漂移主要是由HA球状结构域上出现新的糖链所致。新的糖基化修饰不仅保护了氨基酸残基免遭抗体结合，而且可以调节病毒的受体特异性，这些生物学特性的改变有助于保持IAV的有效传播。尽管已知糖基化修饰在IAV逃逸获得性免疫中发挥重要作用，但由于记忆性CD8+T细胞对IAV的清除能力明显不足，这促使人们重新开始关注以诱导体液免疫为主的流感疫苗[17-18]。开展对不同IAV毒株HA特定位点糖基化的深入研究，将有助于我们认识HA糖基化与抗原距离之间的关系，预测毒株的流行潜力和免疫逃逸能力，由此改进疫苗的研制规划。研究者已经开始模拟HIV糖基化的自然保护作用试图诱导产生具有广泛交叉保护作用的中和抗体。与高度糖基化的HIV相比，IAV的糖基化尚未达到完全屏蔽HA生物学活性的空间极限[19-21]。因此，阐明IAV感染过程中糖基化修饰的机制，明确IAV最佳的糖基化模式，同时构建出能够生产此种糖基化模式的表达系统，最终创建出以糖基化修饰为靶点的新型流感疫苗，将意味着IAV疫苗的开发向前迈出了更为重要的一步。