L-丙氨酸转化菌发酵条件的优化

徐慧，崔颖，王珊珊，田延军，贺强之，韩延雷，刘建军*，朱坤福，祝蕾，姜国政

（1.齐鲁工业大学（山东省科学院）山东省食品发酵工业研究设计院，山东济南250013；2.山东朱氏药业集团有限公司，山东菏泽274300；3.烟台恒源生物股份有限公司，山东烟台265709）

L-丙氨酸，又名L-2-氨基丙酸，是一种具有重要生理功能的非必需氨基酸，在食品、医药等领域具有广泛的应用，并有日益增长的趋势[1-2]。食品应用方面，L-丙氨酸具有甜味与鲜味，被用于食品添加剂，改善食品风味并强化营养，此外其还具有较强的防腐保鲜功能，被用作防腐剂[3-6]。医药应用方面，L-丙氨酸是复合氨基酸注射液的组成成分之一，是合成维生素B5、维生素B6、L-氨基丙醇（盐酸左氧氟沙星）和抗癌药4-羟基水杨醛丙氨酸合锌的前体物质[7-8]。此外，L-丙氨酸可用于合成具有光学活性的聚合物，在生物医学、液晶、手性催化等领域具有重要的价值[9]。

L-丙氨酸可以通过提取法、化学合成法和生物转化法进行制备。其中，酶法转化是目前工业上的主要生产方法，即利用L-天冬氨酸-β-脱羧酶（L-aspartate-β-decarboxylase，Asd）以L-天冬氨酸（L-aspartic acid，L-Asp）为原料经脱羧生成L-丙氨酸。1951 年，MEISTER 等[10]首次发现了韦尔奇梭菌（Clostridiumn welchii）能催化L-Asp 合成L-丙氨酸。随后国内外很多研究人员对此法生产L-丙氨酸进行了深入的研究。SHIBATANI 等[11]以Pseudomonas dacunhae 为产酶菌株，研究不同氨基酸作为氮源对产酶的影响，结果发现L-谷氨酸诱导后产酶量是未添加L-谷氨酸的2 倍。徐虹等[12]通过诱变育种获得一株高Asd 活性的菌株Pseudomonas NX-1，每升培养液可转化L-Asp 达1.4 kg，L-丙氨酸含量可达到90%以上，摩尔转化率接近100%。储瑞蔼等[13]对产酶菌株P.dacunhae CPU9001进行了固定化，并优化了其催化L-Asp 合成L-丙氨酸的发酵条件，每1 kg 固定化细胞可转化2 kg 底物，转化率大于98%，产物收率大于85%，固定化细胞酶活半衰期大于80 d，产品纯度大于98.5%。周丽等[14]以大肠杆菌为出发菌株，敲除编码乳酸、甲酸、乙酸、乙醇、琥珀酸和丙氨酸消旋酶的基因，导入嗜热脂肪芽孢杆菌（Geobacillus stearothmophilus）来源的L-丙氨酸脱氢酶基因（alaD），构建的重组菌以初始浓度30 g/L 的葡萄糖作碳源，经补料发酵得到67.2 g/L L-丙氨酸。徐友强等[7]将来源于睾丸酮丛毛单胞菌的Asd 基因克隆至大肠埃希氏菌CICC11022S 中，构建了一株转化富马酸生产L-丙氨酸的重组工程菌，该菌9 h 转化富马酸生成112.7 g/L 产物，生产速率为12.5 g/（L·h），转化率为93.8%。

Asd 是至今在自然界中唯一的氨基酸-β-脱羧酶，以5′-磷酸吡哆醛（pyridoxal 5′-phosphate，PLP）为辅酶因子，是L-丙氨酸合成的关键酶[15]。汪芳[16]实现了P. dacunhae 来源的Asd（aspD）基因在大肠杆菌中的异源表达，通过定点突变改善了该酶在酸性环境中的催化能力，获得组合突变体酶N34D/L484M，酶比活力达116.27 U/mg，比原始酶提高了76.30%。于封印等[17]首次在大肠杆菌中异源表达不动杆菌来源Asd，对其酶学性质进行分析，为工业生产L-丙氨酸提供参考。Asd 在德阿昆哈假单胞菌（Pseudomonas dacunhae）[18]、产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens）[19]、粪产碱菌（Alcaligenes faecalis）[20]、粪肠球菌（Enterococcus faecalis）[21]、小球诺卡氏菌（Nocardia globerula）[22]等微生物中均有存在，但由于产酶菌株产酶量低、酶活性低，难以实现规模化生产，因此，选育Asd 高产菌株、优化发酵条件和提高酶活力是酶转化生产L-丙氨酸的关键。

本研究在前期通过菌种诱变选育出一株高产Asd的L-丙氨酸转化菌，本文对其产酶条件进行优化，旨在为生物合成L-丙氨酸的工业化生产研究提供科学依据和技术基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌株及培养基

睾丸酮丛毛单胞菌株HY-08D （CGMCC No.6083）：烟台恒源生物股份有限公司。

1.1.2 培养基

斜面及平板培养基：蛋白胨1%，酵母膏0.5%，牛肉膏0.5%，氯化钠0.5%，琼脂2%，pH 7.0～7.2。

液体培养基：玉米浆干粉0.8%，蛋白胨0.8%，磷酸二氢钾0.15%，氯化钠0.5%，硫酸镁0.1%，pH 7.0～7.2。

1.1.3 试剂

酵母膏、牛肉膏、玉米浆、蛋白胨：北京奥博星生物技术有限公司；玉米浆干粉（生化试剂）：山东康源生物科技有限公司；富马酸（分析纯）：烟台恒源生物有限公司；氯化钠、硫酸镁、磷酸二氢钾、葡萄糖（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

XNP-9052BS-III 生化培养箱、XL-YC 恒温摇床：上海馨朗电子科技有限公司；722 型分光光度计：上海天普分析仪器有限公司；LDZX-75KBS 立式压力蒸汽灭菌锅：上海申安医疗器械厂；PY-P10 pH 计、BSA124S-C 电子分析天平：德国赛多利斯公司。

1.3 试验方法

1.3.1 种子培养及发酵培养

种子培养：接一环生长良好的斜面种子至500 mL（装液量50 mL）锥形瓶中，180 r/min，30 ℃，培养12 h～24 h。

摇瓶培养：将种子液按2%（体积分数）接种量转接至500 mL（装液量50 mL）锥形瓶中，180 r/min，培养12 h～24 h。

发酵罐培养：将种子液按0.1%～10%（体积分数）接种量转接至发酵罐（装液量70%）中，150 r/min，培养12 h～24 h。

1.3.2 菌株生长情况测定

发酵液稀释10 倍，在640 nm 测定吸光度值，以OD640代表菌株生长情况。

1.3.3 酶活的测定

取25 mL 发酵液，加入1 g L-Asp，用0.l mol/L HCl调节pH 5.0，在37 ℃水浴摇床中振荡30 min，微波炉加热1 min，终止反应，利用纸层析法分析反应液中L-丙氨酸的含量，计算酶活。每小时催化消耗l μmol LAsp 的酶量定义为一个酶活单位（U）。

1.3.4 培养基组分及培养条件优化

1.3.4.1 碳源优化

基础发酵培养基其余组分和培养条件不变的情况下，以1%的比例，分别添加富马酸、L-Asp、谷氨酸和葡萄糖作为发酵产酶的碳源，以原始培养基为对照考察其对菌株HY-08D 生长及产酶的影响。通过L9（34）正交试验设计对以上4 种碳源添加量进行优化。正交试验设计因素与水平如表1 所示。

表1 菌株HY-08D 碳源正交试验因素与水平Table 1 Factors and levels in orthogonal experiment ofcarbon sources by HY-08D strain

1.3.4.2 氮源、氯化钠和pH 值优化

在优化碳源基础上，控制其它条件不变，以0.8%的比例，分别添加玉米浆干粉、酵母粉和蛋白胨作为发酵的氮源，考察其对菌株HY-08D 生长及产酶的影响。通过正交试验对2 种氮源添加量、氯化钠添加量和pH 值的水平进行优化。正交试验设计因素与水平如表2 所示。

1.3.4.3 扩培级数和接种量优化

采用三级扩培，一级采用摇瓶培养，二级采用2 m3发酵罐，二级培养液分别按0.1%、1.0%、5.0%和10%（体积分数）接种量转接至20 m3发酵罐（装液量为70%）中，150 r/min，30 ℃，培养24 h，每2 h 取样测定OD640和酶活。

表2 菌株HY-08D 氮源、氯化钠和pH 值正交试验因素与水平Table 2 Factors and levels in orthogonal experiment of nitrogen sources,NaCl and pH by HY-08D strain

1.3.4.4 通气量优化

按照优化后配方配制培养基，培养液按10%（体积分数）接种量转接至50 L（装液量42.5 L）发酵罐中培养，150 r/min，30 ℃，用氢氧化钠调节初始pH 6.0，设置通气量分别为6、8、10、12、14 L/min，考察其对菌株HY-08D 生长和产酶的影响。

1.4 统计学分析

正交试验采用正交设计助手V3.1 软件通过直观分析对菌株HY-08D 培养基组分及培养条件进行优化，其它数据采用Origin8.1 软件处理。

2 结果与分析

2.1 碳源优化

2.1.1 碳源种类对菌株HY-08D 生长及产酶的影响

碳源种类对菌株HY-08D 生长及产酶的影响见图1。

图1 碳源对菌株HY-08D 生长及产酶的影响Fig.1 Effect of carbon source on the growth and enzyme production by HY-08D strain

从图1 可以看出，在添加量相同的条件下，选择富马酸、L-Asp、谷氨酸和葡萄糖作为碳源，OD640均有所增加，以谷氨酸为碳源时菌体生长最好，以L-Asp 为碳源时，酶活最高。

2.1.2 正交试验结果

正交试验结果见表3。

表3 菌株HY-08D 碳源添加正交试验结果Table 3 Orthogonal test results of carbon sources addition by HY-08D strain

从表3 可以看出，影响菌株HY-08D 生长的因子顺序为：谷氨酸添加量＞L-Asp 添加量＞葡萄糖添加量＞富马酸添加量，影响菌株HY-08 产酶的因子顺序为：L-Asp 添加量＞谷氨酸添加量＞富马酸添加量＞葡萄糖添加量；结合k 值，适合菌株HY-08D 生长的最佳组合为A1B2C2D3；适合菌株HY-08D 产酶的最佳组合为A2B2C2D3。葡萄糖添加量对菌株产酶影响最小，不再考虑添加，而富马酸添加量对菌株产酶的影响比其对生长的影响要大，综合考虑，最佳碳源组合为A2B2C2，即富马酸1%，L-Asp 1%，谷氨酸1%。在最佳碳源组合下进行验证试验，OD640达到0.536，酶活达到53 927 U/mL，均高于正交试验中各试验组，表明优化后碳源有利于菌株生长和产酶。

2.2 氮源、氯化钠和pH 值优化结果

2.2.1 氮源种类对菌株HY-08D 生长及产酶的影响

氮源种类对菌株HY-08D 生长及产酶的影响见图2。

图2 氮源对菌株HY-08D 生长和产酶的影响Fig.2 Effect of nitrogen source on the growth and enzyme production by HY-08D strain

从图2 可以看出，在添加量相同的条件下，单独添加蛋白胨不利于菌株生长，酶活力较低；单独添加玉米浆干粉和酵母粉，OD640和酶活相对较高，因此，针对两者复合的添加量做了进一步分析以确定最佳配比。除了培养基组分外，适宜的初始pH 值也是十分重要的。Asd 进行脱羧反应时，酸性底物（如L-Asp）的加入会引起反应液pH 值升高，不利于菌株生长，导致酶活力下降甚至失活。

2.2.2 正交试验结果

正交试验结果见表4。

从表4 可以看出，影响菌株HY-08D 生长的因子顺序为：pH 值＞玉米浆干粉添加量＞氯化钠添加量＞酵母粉添加量；影响菌株HY-08D 产酶的因子顺序为：pH 值＞氯化钠添加量＞酵母粉添加量＞玉米浆干粉添加量。结合k 值，适合菌株HY-08D 生长的最佳组合为A1B1C1D2；适合菌株HY-08D 产酶的最佳组合为A3B2C3D2。玉米浆干粉添加量对菌株生长的影响比其对产酶的影响较大，而酵母粉和氯化钠添加量对菌株产酶的影响比其对生长的影响较大，综合考虑，最佳氮源、氯化钠添加量及pH 值组合为A1B2C3D2，即玉米浆干粉0.6%，酵母粉0.8%，氯化钠0.7%，pH 6.0。在最佳培养基组合下进行验证试验，OD640达到0.698，酶活达到54 837 U/mL，均高于正交试验中各试验组，表明优化后的培养基可以提高单位体积培养液中菌体浓度和酶活力。

2.3 扩培级数和接种量优化

不同接种量下菌株HY-08D 三级培养液的生长曲线和酶活曲线分别见图3 和图4。

表4 菌株HY-08D 氮源、氯化钠和pH 值的正交试验结果Table 4 Orthogonal test results of nitrogen sources，NaCl and pH by HY-08D strain

图3 不同接种量下菌株HY-08D 三级培养液生长曲线Fig.3 The growth curve of the third stage culture solution by HY-08D strain

图4 不同接种量下菌株HY-08D 三级培养液酶活曲线Fig.4 The enzyme activity curve of the third stage culture solution by HY-08D strain

微生物发酵种子培养通常采用逐级扩培的方式，但在实际生产中，为了降低接种过程染菌风险，通常采用二级或三级放大。目前，丙氨酸生产中，产酶菌株HY-08D 转化用培养液采用二级培养，一级利用摇瓶培养，二级利用发酵罐培养，接种量只有0.1%，培养周期需要16 h～20 h。因此，本研究对扩培级数和接种量进行了优化，从图3 和图4 可以看出，增加接种量不仅可以缩短菌株生长周期，还可以提高单位发酵液中的Asd酶活。在整个培养阶段，接种量为10%时，培养周期相较于二级扩培缩短了6 h～8 h，酶活提高了约1 倍。

2.4 通气量优化

通气量对菌株HY-08D 发酵过程的影响见表5。

表5 通气量对菌株HY-08D 发酵过程的影响Table 5 Effects of aeration on the fermentation of HY-08D strain

L-丙氨酸转化菌是好氧菌，需通气培养，通气量主要影响培养液的溶氧，进而影响菌株生长代谢。从表5 可以看出，通气量对菌株HY-08D 培养周期和OD 值影响不明显，而对pH 值和酶活影响显著。通气量为10 L/min 时，酶活达到5.51×104U/mL，但继续增加通气量并不会提高酶活力。因此，菌株HY-08D 发酵过程中最适通气量为10 L/min。

3 结论

本研究通过单因素及正交试验对睾丸酮丛毛单胞菌HY-08D 培养基进行优化，获得最佳培养基配方：富马酸1.0%，L-Asp 1.0%，谷氨酸1.0%，玉米浆干粉0.6%，酵母粉0.8%，氯化钠0.7%，磷酸二氢钾0.15%，硫酸镁0.1%，pH 6.0。通过转接试验，确定了菌株HY-08D 转化液采用三级扩培，三级种子的最佳接种量为10%，发酵过程中最适通气量为10 L/min。在上述最佳培养基及培养条件下，优化后培养液中HY-08D 菌体量和酶活较初始提高约1 倍，培养周期缩短6 h～8 h，为实现L-丙氨酸的高效转化和产业化生产奠定了基础。