高良姜精油和纯露的体外抗氧化活性及酪氨酸酶抑制活性研究

刘梦洁，林丽静，姜永超

（1.华中农业大学食品科学技术学院，湖北武汉430070；2.中国热带农业科学院农产品加工研究所，农业农村部热带作物产品加工重点实验室，广东湛江524002；3.海南省果蔬贮藏与加工重点实验室，广东湛江524002）

高良姜，通常指姜科（Zingiberaeeae）山姜属（Alpinia Roxb.）多年生草本植物高良姜（Alpinia officinarum Hance）的根茎。我国广东、广西、云南、海南等地是高良姜的主要产地，其中以广东徐闻县所产高良姜的道地性最强[1]。在我国，高良姜属于“药食同源”的品种[2]，在临床上常用于治疗消化不良、胃寒呕吐等消化道系统疾病[3]；在食品中则被大量用作调味料等[4]。高良姜的主要化学成分包括黄酮类、挥发油、二芳基庚烷类、苯丙素类、糖苷类等[5-6]，这些化学成分对于高良姜具备的生物活性起着非常重要的作用[7]。

植物精油（essential oil）是指经过一定方式萃取、植物所特有的有机化合物。植物精油属于次生代谢产物，室温下为具有挥发性的、小分子的油状液体，主要来源于植物的各器官[8]。纯露（hydrosol）是芳香植物精油在水中以最高浓度溶解量存在的精华[9-10]。通过一定方法获取的高良姜精油和纯露，在食品、日用化学品、医药等领域中具有广阔的应用前景。

本文主要研究超临界法辅助提取的高良姜精油和纯露的体外抗氧化活性，以及高良姜精油的酪氨酸酶抑制活性。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

高良姜：采自广东徐闻县；2，2'-联氮双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二铵盐（ABTS）、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）：上海源叶生物有限公司；过硫酸钾（K2S2O8）：国药集团化学试剂有限公司；羟自由基清除能力检测试剂盒、总抗氧化能力检测试剂盒：北京索莱宝科技有限公司；酪氨酸酶（≥500U/mg）、L-酪氨酸、熊果苷：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；二甲基亚砜（DMSO）、无水乙醇：西陇科学股份有限公司。以上试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

万能粉碎机（DFT-200）：上海鼎广机械设备有限公司；数显恒温水浴锅（SB-2000）：上海爱郎仪器有限公司；电炉（SH1983）：江苏东台市正华电炉厂；pH 计（FE20-FiveEasy PlusTM）：美国Mettler Toledo 公司；紫外-可见分光光度计（UV-1780）：日本Shimadzu 公司。

1.3 方法

1.3.1 高良姜精油和纯露的制备

样品的超临界提取参照林丽静等[11]方法。将高良姜原料除杂、洗净、粉碎。称取1 kg 粉碎后的高良姜装入超临界CO2萃取装置的物料釜，密封后连接装置管路，取400 mL 纯净水加至纯露萃取容器内，在萃取温度40 ℃、萃取压力14 MPa 条件下萃取2 h～3 h，得到超临界辅助提取法制备的高良姜精油和纯露。

样品的水蒸气提取参照袁源等[12]方法。称取一定量的高良姜，按料液比1 ∶8（g/mL）～1 ∶10（g/mL）浸水蒸馏，每隔2 h 停止加热20 min，共蒸馏6 h，得到水蒸气蒸馏高良姜精油和纯露。

1.3.2 总抗氧化能力的测定

采用总抗氧化能力检测试剂盒测定样品的总抗氧化能力。将FeSO4标准溶液稀释至梯度浓度，按标准溶液与试剂二1 ∶1 的体积比充分混匀后反应10 min，去离子水调零，测定波长593 nm 处吸光度值（蒸馏水作空白），计算ΔA=A标准-A空白。以Fe2+终浓度（0.000 78、0.001 56、0.003 125、0.006 25、0.012 5、0.025、0.05、0.1、0.2 μmol/mL）为横坐标，以ΔA 为纵坐标绘制标准曲线Y=16.742X+0.044。

取超临界辅助提取法和水蒸气蒸馏法所得高良姜精油和纯露样品，按试剂盒说明书操作。充分混匀反应10 min，以去离子水调零，取200 μL 反应液于微量玻璃比色皿，分别测定593 nm 处的吸光度值。对照管只测一次，各吸光度值取3 次平行的平均值。计算ΔA′=A测定-A对照。

总抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）计算如式（1）。

式中：X 为测定样品的ΔA′带入标准曲线方程求得的标准离子浓度，μmol/mL；V反总为反应总体积，1.02 mL；V样为反应中样品体积，0.03 mL；T-AOC为每毫升样品抗氧化能力达到同样吸光度变化值（ΔA）所需的标准离子（Fe2+）浓度，μmol/mL。

1.3.3 羟自由基清除能力的测定

采用羟自由基清除能力检测试剂盒测定样品的羟自由基清除能力。取超临界辅助提取法和水蒸气蒸馏法所得高良姜精油和纯露样品，按表1 操作，在1.5 mL 离心管中加入相应试剂。

表1 测定操作标准Table 1 Measurement operation μL

其中管中加入试剂一、二、三后需先混匀，防止颜色不均一，然后再依次加入样品、试剂四和去离子水，混匀后37℃孵育60 min。10 000 r/min 常温（25 ℃）离心10 min，取200 μL 上清液于微量玻璃比色皿分别测定536 nm 处的吸光度值。空白管、对照管和测定管吸光度值分别记为A空、A对和A测。对照管和空白管只测一次测定管各吸光度值取3 次平行的平均值。

羟自由基清除率计算如式（2）。

1.3.4 ABTS+自由基清除能力的测定

精确称取0.038 4 g ABTS 试剂溶于10 mL 蒸馏水，精确称取0.006 6 g 过硫酸钾溶于10 mL 蒸馏水，将ABTS 溶液（7.00 mmol/L）与硫酸二氢铵溶液（2.45 mmol/L）按体积比1∶1 混合，室温（25 ℃）下避光反应12 h～16 h，得到ABTS+自由基储备液，于4 ℃避光保存备用。将一定体积的ABTS+自由基储备液用无水乙醇稀释40 倍～50 倍，使稀释液在波长734 nm 处吸光度值为0.7±0.02（无水乙醇调零），此时得到ABTS+·工作液。

准确称取0.125 0 g 高良姜精油，用无水乙醇定容至100 mL，得到1.25 mg/mL 高良姜精油的乙醇溶液，并逐步稀释分别得到0.625、0.362 5、0.181 3、0.090 6、0.045 3 mg/mL 的样品稀释液。超临界辅助提取法所得高良姜纯露分别用无水乙醇稀释得到10、20、30、40、50 mL/100 mL 稀释液。按表2 配制反应混合液于15 mL 离心管，充分摇匀后室温（25 ℃）下避光反应30 min，以无水乙醇调零，测定各混合液在734 nm 波长处的吸光度值。每组设置3 个平行试验。

表2 反应混合液配制比例Table 2 Proportion of reaction mixture mL

ABTS+自由基清除率计算如式（3）。

式中：A0、A1、A2分别为ABTS+自由基清除能力测定反应中配制的对照管、测定管、空白管反应液在517 nm 波长处测得的吸光度值。

以样品液浓度（mg/mL）为横坐标，自由基清除率为纵坐标作标准曲线，计算IC50（ABTS+自由基清除率为50%时所需的样品质量浓度）。

1.3.5 DPPH 自由基清除能力的测定

配制0.1 mmol/L DPPH-乙醇溶液，0.625、0.362 5、0.181 3、0.090 6、0.045 3、0.022 7 mg/mL 的高良姜精油稀释液，以及20、40、60、80 mL/100 mL 的高良姜纯露稀释液。按表3 配制反应混合液，置于15 mL 离心管。

表3 反应混合液配制比例Table 3 Proportion of reaction mixture mL

混合液充分摇匀后室温（25 ℃）下避光反应30 min，以去离子水调零，测定各混合液在517 nm 波长处的吸光度值。每组设置3 个平行试验。

DPPH 自由基清除率计算如式（4）。

式中：A0、A1、A2分别为DPPH 自由基清除能力测定反应中配制的对照管、测定管、空白管反应液在517 nm 波长处测得的吸光度值。

以样品液浓度（mg/mL）为横坐标，自由基清除率为纵坐标作标准曲线，计算IC50（DPPH 自由基清除率为50%时所需的样品质量浓度）。

1.3.6 酪氨酸酶抑制活性测定

参照孙玉洁[13]的方法并稍作修改。配制pH 6.8 磷酸缓冲液，于4℃保存备用。准确称取0.135 9 g L-酪氨酸于烧杯中，滴入5 滴～10 滴浓盐酸，加水约30 mL，在电炉上缓慢加热溶解，然后滴加氢氧化钠溶液调节pH值至7.0，用去离子水定容至100 mL，制成7.5 mmol/L L-酪氨酸溶液。准确称取高良姜精油和纯露各0.1000 g，分别溶于20 mL 二甲基亚砜，得到5 mg/mL 样品溶液，然后逐步稀释得到2.5、1.25、0.625、0.312 5 mg/mL 样品溶液；按同样方法得到5、2.5、1.25、0.625、0.312 5 mg/mL熊果苷溶液。称取0.010 0 g 酪氨酸酶干粉（-20 ℃），溶于50 mL 去离子水，制成100 U/mL 酶液，于4 ℃保存，并在4 h 内使用。按表4 配制反应体系，以熊果苷作为阳性对照。

在反应体系中，待测液（包括样品与阳性对照熊果苷）的实际反应浓度为0.5、0.25、0.125、0.062 5、0.031 25 mg/mL。依次向10 mL 离心管中加入磷酸钠缓冲液、不同浓度梯度的待测液和酶液，30 ℃水浴10 min；然后继续在水浴条件下加入反应底物L-酪氨酸，并立即开始计时，反应20 min 时停止水浴，测定475 nm 处吸光度值。其中，测定吸光度值时，试验组用含相应种类和浓度待测液的阴性对照组1 调零，标准对照组用阴性对照组2 调零。试验组各浓度均进行3次平行试验。

用下列公式计算待测液对酪氨酸酶抑制活性的抑制率，并依据酶抑制率-浓度曲线拟合方程估算半数抑制浓度（IC50）。

式中：A、B 分别为标准对照组和试验组测得的吸光度值。

1.4 数据处理

数据以平均值±标准差（Mean±SD）表示。

2 结果与分析

2.1 超临界辅助提取高良姜精油和纯露的体外抗氧化活性

2.1.1 总抗氧化能力

与水蒸气蒸馏法提取的高良姜精油和纯露相比较，超临界法辅助提取高良姜精油和纯露的总抗氧化能力如图1 所示。

图1 各样品的总抗氧化能力Fig.1 Total antioxidant capacity of different samples

由图1 可知，试验中各样品的总抗氧化能力依次为：超临界辅助提取高良姜精油＞水蒸气蒸馏高良姜精油＞超临界辅助提取纯露＞水蒸气蒸馏高良姜纯露。其中，超临界辅助提取的高良姜精油的总抗氧化能力明显强于其它样品。

2.1.2 羟自由基清除能力

超临界辅助提取法及水蒸气蒸馏法提取高良姜精油和纯露的羟自由基清除能力如表5 所示。

表5 各样品的羟自由基清除能力Table 5 Hydroxyl radical scavenging ability of different samples

由表5 可知，高良姜精油的羟自由基清除能力要强于相同方法条件下提取的高良姜露的羟自由基清除能力；就制备方法而言，以超临界辅助法制备高良姜精油、纯露对羟自由基的清除能力稍逊于水蒸气蒸馏法。

按照公式（2）确定的超临界辅助提取和水蒸气蒸馏高良姜纯露的羟自由基清除率表现为计算上的负值。出现这一现象的原因，可能是样品对羟自由基反应体系的抑制微弱，同时在抑制反应过程中羟自由基与样品中某些化学成分反应产生了其它颜色物质，致使在测定波长处的吸光度甚至低于对照管吸光度。

2.1.3 ABTS+自由基清除能力

超临界辅助提取高良姜精油和纯露的ABTS+自由基清除能力如图2 所示。

图2 高良姜精油和纯露的ABTS+自由基清除能力Fig.2 ABTS+·scavenging ability of essential oil and hydrolate from Alpina officinarum Hance

由图2 可知，随样品浓度的增加，各样品对ABTS+自由基的清除能力逐渐增大。其中，超临界辅助提取高良姜精油对ABTS+自由基清除率的增加程度随浓度增加而逐渐减缓，清除率趋于稳定，超临界辅助提取高良姜精油对ABTS+自由基清除率的半数清除浓度IC50约为0.141 mg/mL；水蒸气蒸馏法所得高良姜精油的IC50约为6.509 mg/mL。超临界辅助提取高良姜纯露对ABTS+自由基清除的IC50约为31 mL/100 mL（试验纯露原液31 mL 稀释至100 mL）；水蒸气蒸馏高良姜纯露不经稀释时（即纯露原液）的ABTS+自由基清除率不足50%，仅约43.3%。由上述结果可知，超临界辅助提取高良姜精油/纯露的ABTS+自由基清除能力分别强于水蒸气蒸馏高良姜精油/纯露。

2.1.4 DPPH 自由基清除能力

超临界辅助提取高良姜精油和纯露的DPPH 自由基清除能力如图3 所示。

图3 高良姜精油和纯露的DPPH 自由基清除能力Fig.3 DPPH·scavenging ability of essential oil and hydrolate from Alpina officinarum Hance

随样品浓度的增加，各精油样品对DPPH 自由基的清除能力趋于稳定，各纯露样品对DPPH 自由基的清除能力逐渐增大，与对ABTS+自由基清除能力的变化趋势相似。其中，超临界辅助提取高良姜精油对DPPH 自由基清除的IC50约为0.088 mg/mL；水蒸气蒸馏法所得高良姜精油的反应浓度为0.625 mg/mL（＞0.088 mg/mL）时对DPPH 自由基清除率仅为1.1%，反应浓度增大到10mg/mL 时清除率仅为13.2%（＜50%）。超临界辅助提取高良姜纯露对DPPH 自由基清除的IC50约为74 mL/100 mL，水蒸气蒸馏高良姜纯露原液的DPPH 自由基清除率不足50%，仅约12.8%。由上述结果可知，超临界辅助提取高良姜精油和纯露，其DPPH 自由基清除能力均显著强于水蒸气蒸馏所得的对应样品。

2.2 超临界辅助提取高良姜精油的酪氨酸酶抑制活性超临界辅助提取高良姜精油以及阳性对照物熊

果苷的酪氨酸酶抑制能力如图4 所示。

图4 超临界辅助提取高良姜精油的L-酪氨酸酶抑制能力Fig.4 Inhibition of L-tyrosinase in essential oil from Alpina officinarum Hance extracted by supercritical fluid

在试验范围内，随反应体系中高良姜精油浓度的增加，其对L-酪氨酸酶的抑制强度先增大后又减小。在浓度为0.125 mg/mL 时，高良姜精油对体系中L-酪氨酸酶抑制率最高，约为64.0%，明显高于阳性对照熊果苷对酪氨酸酶的抑制率；在浓度0.5 mg/mL 时，对体系中L-酪氨酸酶抑制率则约为30.0%。

3 结论与讨论

本试验结果显示，以超临界流体法辅助提取的高良姜精油和纯露，在相同条件下具有比水蒸气蒸馏法所得相应精油或纯露更强的综合抗氧化活性，总抗氧化能力值更大，对ABTS+自由基以及DPPH 自由基的清除率更高。超临界辅助提取法提取的高良姜精油对酪氨酸酶的抑制率随反应浓度增加呈现先增后减的变化。在超临界流体辅助提取法提取高良姜精油和纯露的过程中，萃取温度低于水蒸气蒸馏法，操作条件较温和[14-15]，从而减少提取产物中一部分化学成分由于高温导致的损失[16]，这可能是超临界辅助提取法所得样品体外抗氧化活性更好的原因。通过本文研究，结合对超临界辅助提取高良姜精油和纯露样品的成分分析，有望为高良姜精油和纯露的应用研究及超临界流体萃取精油和纯露的方法推广提供理论支持。