黄曲霉毒素B1荧光定量快速检测试纸卡和仪器技术性能优化研究*

巩性涛 王 培 肖理文 宋永泉 徐 秀 赵 皖

(1 山东省粮油检测中心 250101)(2 南京微测生物科技有限公司 210000)

黄曲霉毒素B1(Aflatoxin B1简写为AFB1)是二氢呋喃氧杂萘邻酮的衍生物，含有一个双呋喃环和一个氧杂萘邻酮(香豆素)，具有强致癌性以及剧毒性，是迄今发现的各种真菌毒素中最稳定的一种。从1993年开始黄曲霉毒素被认定为世界卫生组织(WHO)癌症研究机构划定的一类致癌物，是世界公认的三大强致癌物质之一，而黄曲霉毒素B1由于毒性最大，污染最重，是危害最大的一种黄曲霉毒素[1]。

黄曲霉毒素B1污染的食物主要是花生、玉米、稻谷、小麦、花生油等粮油食品，且以南方高温、高湿地区受污染最为严重，北方黄淮地区特别是玉米、小麦、花生污染程度上升尤为明显[2]。《食品安全国家标准 食品中真菌毒素限量》(GB 2761-2011)中对粮食谷物及其制品中黄曲霉毒素B1的最高限量为20 μg/kg，《饲料卫生标准》(GB 13078-2001)中对不同种类的饲料中黄曲霉毒素B1的最高限量标准从10 μg/kg～50 μg/kg不等。

目前，国标法测定黄曲霉毒素B1采用HPLC法，需要大型的仪器设备，价格昂贵，操作过程复杂、时间较长，且无法在现场和基层小型实验室使用。除此之外，也有采用黄曲霉毒素B1酶联免疫试剂盒或胶体金快速检测试纸卡用于大量样品的筛查，操作简便，检测快速，成本也较低，但准确性和重复性较差，容易造成假阳性或者假阴性，国外同类进口设备和试剂条准确性和重复性虽然有所提高，但成本高，粮油收储、粮食加工和饲料企业难以接受。为此，山东粮油检测中心与南京微测生物科技有限公司对基于荧光定量免疫层析平台的黄曲霉毒素B1荧光定量快速检测试纸卡进行了产品的进一步优化升级，使之操作简单、准确性和重复性较高，且使用成本较进口降低30%，能更好满足不同客户的日常检测需求，确保粮食和食品安全。

1 材料和方法

1.1 试剂和材料

除注明外，均为分析纯，试验用水均为国标一级标准蒸馏水。

黄曲霉毒素B1荧光定量检测试纸卡由乳胶垫、NC膜、样品垫及吸收垫组成，乳胶垫上包裹有荧光微球标记黄曲霉毒素B1抗体；NC膜上喷涂有黄曲霉毒素B1抗原的检测线和喷涂有羊抗兔二抗的控制线。样品提取液、样品稀释液、标准曲线ID卡及标准曲线条形码均为上海生产。黄曲霉毒素B1的标准品：购自Sigma公司；大米、玉米、小麦、面粉等样品从超市购得或从企业获得。麸皮，小麦、面粉等饲料样品从粮食加工和收储企业获得。

1.2 仪器与设备

FD-600型荧光免疫定量分析仪和FD-2000型试纸卡恒温孵育器：上海生产；低速离心机：上海生产；漩涡混匀器：海门生产；电子天平：Sartorius。

1.3 试验方法

1.3.1 样品的前处理 取具有代表性的待测样品500 g，用粉碎机粉碎1 min后过20目筛，收集过筛后的均匀细小样品。称取过筛后的样品5.0 g±0.02 g于50 mL离心管中，加入25 mL提取液，用漩涡混匀器振荡5 min(或者摇床振荡5 min)后，4000RPM离心2 min。

1.3.2 检测过程 取100 μL离心上清液加入500 μL 样品稀释液中，用漩涡混匀器混匀3 s～5 s，然后取100 μL加入到黄曲霉毒素B1荧光定量检测试纸卡的加样孔中，置于37℃恒温孵育器中温育8 min，8 min后将试纸卡插入荧光免疫定量分析仪中读数，读数值即为样品的实际检测浓度。当检测值大于75 μg/kg时，可将离心上清液稀释5倍后再进行检测，所得读数值乘以对应的稀释倍数即为最终的检验结果。

1.3.3 试纸卡原理 当将待测样品滴加在试纸卡加样区时，样品中的黄曲霉毒素B1与结合垫中荧光微球标记的黄曲霉毒素B1抗体结合并通过毛细作用向前层析，到达检测区后，检测线T线上固定的黄曲霉毒素B1抗原与剩余未结合的荧光微球标记黄曲霉毒素B1抗体结合。检测线T线上结合的荧光微球标记抗体的量与样品中待测物的量成反比，质控线C线结合的荧光标记物与样品中待测物的量无关，剩余或其它荧光标记物继续层析达到吸收区。反应结束后，使用荧光定量快速检测仪读取T线和C线的荧光强度并计算T/C值，通过仪器内置的标准曲线即可计算出样品中黄曲霉毒素B1的含量。

1.3.4 试纸卡优化 在单T线的基础上，增加1条矫正T线，形成质控线C线1条、检测线T线2条的方式。

2 结果分析

2.1 黄曲霉毒素B1试纸卡检测线数量由两线优化成三线的实验结果

选用国标法测定黄曲霉毒素B1浓度值为空白的样本中分别添加黄曲霉毒素B1的浓度为2.5 μg/kg、5 μg/kg、10 μg/kg、25 μg/kg、50 μg/kg，然后按照黄曲霉毒素B1试纸卡检测方法同时进行两线及三线试纸卡检测，每个加标样本各检测2个平行样，对比试纸卡灵敏度，检测结果见表1；选取高、中、低3个加标浓度点，每个加标样本检测6个平行样，检测对比试纸卡的重复性，检测结果见表2。

表1 黄曲霉毒素B1两线与三线试纸卡的灵敏度 (单位：μg/kg)

表2 黄曲霉毒素B1两线与三线试纸卡的重复性 (浓度单位：μg/kg)

从表1可知，黄曲霉毒素B1三线试纸卡的2.5 μg/kg检测灵敏度为22.03%；两线试纸卡的2.5 μg/kg检测灵敏度为16.39%；从单一2.5 μg/kg浓度点检测灵敏度对比，三线试纸卡灵敏度更高；且综合对比不同浓度的检测灵敏度，也得出黄曲霉毒素B1三线试纸卡灵敏度较两线试纸卡更高。从样本加标检测灵敏度对比，可选黄曲霉毒素B1三线试纸卡。

从表2可知，筛选高、中、低三个浓度点进行重复性检测，黄曲霉毒素B1三线试纸卡检测变异系数CV范围为4.26%～8.11%；两线试纸卡检测变异系数CV范围为7.50%～11.25%；对比三线试纸卡与两线试纸卡的检测变异系数CV范围，三线试纸卡检测变异系数CV范围更小，重复性更高；从样本加标检测重复性对比，可选黄曲霉毒素B1三线试纸卡。

综合黄曲霉毒素B1三线试纸卡与两线试纸卡的灵敏度与重复性对比，选择黄曲霉毒素B1三线试纸卡。

2.2 选用检测线数量为三线的黄曲霉毒素B1试纸卡进行产品性能检测

2.2.1 黄曲霉毒素B1试纸卡检出限及定量限实验结果 选用国标法测定黄曲霉毒素B1浓度值为空白的样本20份，然后按照黄曲霉毒素B1试纸卡检测方法进行检测，每个样本检测1个试纸卡。检测结果见表3。

由表3中检测数据分析可知：黄曲霉毒素B1试纸卡的检出限为0.4 μg/kg；定量限为0.983 μg/kg。

2.2.2 黄曲霉毒素B1试纸卡的检测范围的实验结果 选用国标法测定黄曲霉毒素B1浓度值为空白的样本中分别添加黄曲霉毒素B1的浓度为1 μg/kg、2.5 μg/kg、5 μg/kg、10 μg/kg、25 μg/kg、50 μg/kg、75 μg/kg，然后按照黄曲霉毒素B1试纸卡检测方法进行检测，每个加标样本各检测2个平行样。检测结果见表4。

通过表4的检测数据可知，在空白样本中添加黄曲霉毒素B1的浓度为1 μg/kg时，检测灵敏度为10.41%，与空白样本检测存在梯度差；阴性样本加标浓度从1 μg/kg～75 μg/kg时，检测灵敏度范围为10.41%～95.07%，且不同浓度点检测抑制率分散率较好，故黄曲霉毒素B1可定量检测范围为1 μg/kg～75 μg/kg。

表4 黄曲霉毒素B1试纸卡的检测范围 (单位：μg/kg)

2.2.3 黄曲霉毒素B1试纸卡的准确度和重复性实验结果 选用国标法测定黄曲霉毒素B1浓度值为空白的样本中分别添加黄曲霉毒素B1浓度为1 μg/kg、2.5 μg/kg、5 μg/kg、10 μg/kg、25 μg/kg、50 μg/kg、75 μg/kg，然后按照黄曲霉毒素B1荧光定量试纸卡的检测方法进行检测，每个加标样本各检测3个平行样。检测结果见表5。

通过表5可知，大米样本的加标回收率为88.34%～103.17%；玉米样本的加标回收率为85.72%～109.09%；小麦样本的加标回收率为95.40%～117.53%；综合三种不同基质样本加标检测回收率范围为85.72%～117.53%，说明样本加标检测回收率高，黄曲霉毒素B1试纸卡检测准确度较高。

表5 黄曲霉毒素B1试纸卡的准确度和重复性 (单位：μg/kg)

大米样本的变异系数CV范围为0.64%～10.81%；玉米样本的重变异系数CV范围为3.29%～11.25%，小麦样本的变异系数CV范围为2.19%～11.58%；综合三种不同基质样本加标检测变异系数CV范围为0.64%～11.58%，说明黄曲霉毒素B1试纸卡整体变异系数CV较小，试纸卡重复性较好。

2.2.4 黄曲霉毒素B1试纸卡稳定性的实验结果 黄曲霉毒素B1检测在2℃～10℃环境下，并在每个月固定日期进行样本检测，筛选固定不同基质已知不同浓度值样本(拜发质控物)用于试纸卡稳定性检测，每个样本检测1个试纸卡，检测结果见表6。

表6 黄曲霉毒素B1试纸卡的稳定性

通过表6数据可知，黄曲霉毒素B1试纸卡在2℃～10℃保存8个月，不同基质样本的检测偏差范围为4.92%～10.82%，说明黄曲霉毒素B1试纸卡在正常温度8个月的保存整体偏差在10%以内，说明产品稳定性较好。

2.3 利用黄曲霉毒素B1试纸卡测定仪器的稳定性与台间差

2.3.1 采用一台仪器设备，每小时测定固定值样本浓度，连续测定12次，以该方法12 h测定数据的标准差和极差是否超过标准方法中规定的重复性要求来考察设备稳定性。检测结果见表7。

通过表7的计算分析可知，该仪器测定的稳定性标准差和极差均没有查过标准方法中规定的重复性要求，仪器稳定性好。

表7 仪器的稳定性

2.3.2 两台设备分别对6个浓度梯度的玉米样本进行双试验检测，采用配对t检验法比较两台仪器的检测结果是否存在显著差异。检测结果见表8。

表8 仪器的台间差 (单位：μg/kg)

由表8的分析数据可知，td=0.43，查t分布表，t0.05,5=2.5706，td

2.4 设备与产品优化后进行玉米粉中黄曲霉毒素B1不同单位验证检测

通过表8～表16的计算分析可知，验证单位1、验证单位2、验证单位3三家验证单位检测结果平均值也符合国家标准适用性要求，说明设备与产品稳定性较好。

表9 检出限与定量限：玉米基质 (单位：μg/kg)

表10 浓度水平1准确性结果：玉米基质 (单位：μg/kg)

表11 浓度水平2准确性结果：玉米基质 (单位：μg/kg)

表12 浓度水平3准确性结果：玉米基质 (单位：μg/kg)

表13 浓度水平1台间差结果：玉米基质 (单位：μg/kg)

表14 浓度水平2台间差结果：玉米基质 (单位：μg/kg)

表15 浓度水平3台间差结果：玉米基质 (单位：μg/kg)

表16 浓度水平2重复性结果：玉米基质 (单位：μg/kg)

2.5 优化试纸卡与其他产品检测对比

通过表17中优化产品同国外知名品牌产品对同一样本检测数据对比，从CV与回收率数据分析，优化产品检测效果优于进口产品，说明可以取代进口产品。

表17 优化产品与进口产品黄曲霉毒素B1质控品检测结果 (单位：μg/kg)

3 结论

从黄曲霉毒素荧光定量试纸卡三线与两线的灵敏度、不同浓度点梯度与重复性等的检测数据对比可知，三线试纸卡灵敏度更高；不同浓度点分布更合理，且三线试纸卡检测变异系数CV范围更小，重复性更高。且通过对三线试纸卡检测限、检测范围、不同基质样本重复、稳定性等检测验证实验可知，优化后三线试纸卡的准确度、重复性、稳定性等均达到更优的效果，更能满足检测需求。另外荧光定量分析仪根据重复性要求，仪器稳定性好且两台设备的测定结果之间不存在显著性差异。

综上所述，普通免疫层析快检产品通常采用单检测线(T线)定量方法，产品研发周期更短，生产工艺更为简单，成本也更低，但检测结果的精密度难以控制，导致结果的重复性较差。黄曲霉毒素B1荧光定量快速检测试纸卡在单T线的基础上，增加一条矫正T线，与质控线(C线)一起，形成“双保险”，大大提升了检测结果的精密度和重复性。