响应面法优化贝莱斯芽孢杆菌YB19产中性蛋白酶发酵条件

郭艳霞，贾丽艳,2*，畅盼盼,2，张丽,2，周士琦,2

(1.山西农业大学 食品科学与工程学院，山西 晋中 030801；2.山西省白酒生物工程研究所教育创新中心，山西 晋中 030801)

蛋白酶能催化肽键水解成氨基酸或短肽的酶类，广泛存在于动物、植物和微生物中[1]， 是工业化酶制剂中应用最为广泛的酶制剂之一；蛋白酶根据初始pH进行分类，分为中性蛋白酶、酸性蛋白酶和碱性蛋白酶。中性蛋白酶作为一种生物催化剂，作用底物广泛，主要应用于食品工业、皮革加工、纺织、化妆品等行业[2-3]，而且其反应条件温和，是目前蛋白质水解处理的重要酶种，近年来更发展出许多新的用途[4-6]，比如在焙烤食品和饮料澄清等方面都起着重要的作用，它可以缩短奶酪的老熟期[7-8],消除果汁中的沉淀而且增加果汁中可溶性固形物的含量[9]。蛋白酶的活性容易受到客观条件的影响，如在常温保存和应用过程中通常会出现不稳定情况，尤其在强酸、强碱及高渗等极端条件下容易失活，这些条件限制了蛋白酶的广泛应用。因此，如何研发新型、对环境耐受性强的中性蛋白酶，成为目前工业生产亟需解决的问题。

贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)是芽孢杆菌属中一种新兴的功能性菌种[10-12]，革兰氏阳性，具有分泌多种酶(如纤维素酶、蛋白酶等[13])的能力，被广泛应用于食醋酿造、其他食品发酵及农业领域[14]。课题组前期从高温大曲中分离获得的一株耐高温贝莱斯芽孢杆菌YB19(简称菌株YB19)，该菌株具有产耐高温中性蛋白酶的能力[15]。本文以菌株YB19为研究对象，以麸皮为发酵基质，通过单因素及响应面法优化产中性蛋白酶发酵条件，为该菌株以及所产蛋白酶的开发应用奠定了基础。

1 材料和方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌种与培养基

贝莱斯芽孢杆菌YB19：山西农业大学生物工程实验室提供。

种子培养基：酵母膏5 g/L，胰蛋白胨10 g/L，氯化钠10 g/L，pH 7.0～7.2，121 ℃灭菌30 min[16]。

发酵用培养基：麸皮12 g，豆粕粉3 g，水15 mL，pH自然，121 ℃灭菌30 min。

1.1.2 试剂

NaCl(分析纯)：天津市鼎盛鑫化工有限公司；胰蛋白胨：北京维百奥生物科技有限公司；干酪素(分析纯)：天津市登峰化学试剂厂；酵母膏、福林酚(分析纯)：北京索莱宝科技有限公司；三氯乙酸、Na2CO3、NaOH(分析纯)：天津市科密欧化学试剂有限公司；乳酸(分析纯)：天津市风船化学试剂科技有限公司；乳酸钠：天津市光复精细化工研究所；Na2HPO3、NaH2PO3(分析纯)：天津市恒兴化学试剂制造有限公司；麸皮、豆粕粉：太谷县农贸市场。

1.2 仪器与设备

V-1300型可见分光光度计 上海美析仪器有限公司；HC5002电子天平 慈溪市华徐衡器实业有限公司；H4数显恒温水浴锅 常州国华电器有限公司；SW-CJ-1D型净化工作台 苏州净化设备有限公司；立式压力蒸汽灭菌器 上海博讯实业有限公司医疗设备厂；DHP-9032型恒温培养箱 上海一恒科学仪器有限公司；ZWY-1102C型恒温培养振荡器 上海智城分析仪器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株的培养及发酵条件

将活化的菌株YB19以3%的接种量接种于种子培养基中，37 ℃、200 r/min振荡培养24 h作为种子液。将种子液转接到发酵用培养基中，在不同条件下进行发酵培养。

1.3.2 中性蛋白酶活力测定

称取4 g发酵培养基，加pH 7.2磷酸缓冲液20 mL，40 ℃恒温浸提30 min，按照GB/T 23527-2009《蛋白酶制剂》蛋白酶活性的测定方法对高产蛋白酶菌株的蛋白酶活力进行测定[17]。

1.3.3 设计单因素对中性蛋白酶活力影响的试验

在初始发酵培养基和培养条件的基础上，研究发酵时间(12，24，48，72，96 h)、发酵温度(27，32，37，42，47 ℃)、接种量(1%、1.5%、2%、3%、5%)、水分含量(5，10，15，25，35 mL)、豆粕粉含量(10%、15%、20%、25%、30%)对中性蛋白酶活力的影响，从而确定最佳发酵条件。

1.3.4 Plackett-Burman(PB)试验

依据单因素试验的结果，对影响菌株YB19产中性蛋白酶能力的5个因子(发酵时间、发酵温度、接种量、水分含量、豆粕含量)进行PB试验，试验设计见表1。

表1 Plackett-Burman试验因素与水平 Table 1 The factors and levels of Plackett-Burman test

1.3.5 响应面优化试验

以单因素和PB试验结果为基础，采用三因素三水平的Box-Behnken响应而试验设计法，以发酵时间、接种量和水分含量为自变量，以中性蛋白酶的酶活为指标进行优化，用Design-Expert 8.0软件对试验数据进行分析。响应面试验因素与水平见表2。

表2 响应面试验因素与水平Table 2 The factors and levels of response surface test

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 发酵时间对菌株YB19产中性蛋白酶能力的影响

考察不同发酵时间对菌株YB19产中性蛋白酶能力的影响，结果见图1。

图1 发酵时间对菌株产YB19中性蛋白酶能力的影响Fig.1 Effect of fermentation time on neutral protease activity produced by Bacillus velezensis YB19

由图1可知，起初中性蛋白酶活力随着时间的延长呈现上升趋势，24 h时活力最高，为364.54 U/g，之后反而逐渐下降，可能是因为随着时间的延长，培养基中的营养成分逐渐耗尽，并且积累了很多次级代谢产物，抑制了该菌株产中性蛋白酶活力，培养时间为96 h时中性蛋白酶活力最低。结果表明，当发酵时间为24 h时，菌株YB19产中性蛋白酶能力最强。

2.1.2 发酵温度对菌株YB19产中性蛋白酶能力的影响

研究不同发酵温度对菌株YB19产中性蛋白酶能力的影响，结果见图2。

图2 发酵温度对菌株YB19产中性蛋白酶能力的影响Fig.2 Effect of fermentation temperature on neutral protease activity produced by Bacillus velezensis YB19

由图2可知，温度为32 ℃时中性蛋白酶活力最高，之后随着温度的升高，中性蛋白酶活力开始降低，温度在37～47 ℃之间，中性蛋白酶活力相对比较稳定，所以选择32 ℃作为后续试验的发酵温度。结果表明，当发酵温度为32 ℃时，菌株YB19产中性蛋白酶能力最强。

2.1.3 接种量对菌株YB19产中性蛋白酶能力的影响

选择5种不同的接种量，经发酵后测定中性蛋白酶活力，结果见图3。

图3 接种量对菌株YB19产中性蛋白酶能力的影响Fig.3 Effect of inoculation amount on neutral protease activity produced by Bacillus velezensis YB19

由图3可知，当接种量为3%时，中性蛋白酶酶活力高达364.4 U/g，与1%时的中性蛋白酶酶活力相比增加58%，但接种量为5%时，中性蛋白酶活力反而下降。这可能是因为发酵初期菌体迅速生长，营养物质消耗速度快，并产生大量代谢产物及有毒物质，抑制菌体后期生长，导致酶活降低[18]。因此，选择3%为最佳接种量。结果表明，当接种量为3%时，菌株YB19产中性蛋白酶能力最强。

2.1.4 水分含量对菌株YB19产中性蛋白酶能力的影响

图4 水分含量对菌株YB19产中性蛋白酶能力的影响Fig.4 Effect of water content on neutral protease activity produced by Bacillus velezensis YB19

由图4可知，菌株YB19产中性蛋白酶活力随着发酵培养基中水分含量的增加而增大，当水分含量为15 mL时中性蛋白酶活力最高，为363.46 U/g。此后，水分含量再增加反而抑制了该菌株产中性蛋白酶活力。所以，发酵培养基中最佳水分含量为15 mL。结果表明，当水分含量为15 mL时，菌株YB19产中性蛋白酶能力最强。

2.1.5 豆粕含量对菌株YB19产中性蛋白酶能力的影响

选择豆粕粉为发酵用培养基中的氮源，考察不同添加量对贝莱斯芽孢杆菌产中性蛋白酶活力的影响，见图5。

图5 豆粕含量对菌株YB19产中性蛋白酶能力的影响Fig.5 Effect of soybean meal content on neutral protease activity produced by Bacillus velezensis YB19

由图5可知，该菌株产中性蛋白酶活力随着培养基中豆粕粉含量的增加先升高后降低，当豆粕含量为20%时，中性蛋白酶活力最高，为363.98 U/g。当豆粕粉含量大于20%时中性蛋白酶活力反而降低，可能是由于发酵过程中分解氮源产生了肽类化合物，竞争性抑制了蛋白酶的活力。结果表明，当豆粕粉含量为20%时，菌株YB19产中性蛋白酶能力最强。

2.2 Plackett-Burman(PB)试验

根据单因素试验结果，利用PB试验对发酵时间、发酵温度、接种量、水分含量和豆粕含量5个因素进行显著因子的筛选，分12组，试验设计见表3。

表3 Plackett-Burman试验设计及结果 Table 3 Plackett-Burman test design and results

表4 Plackett-Burman试验方差分析Table 4 Variance analysis of Plackett-Burman test

由表4可知，P(A发酵时间)=0.033，P(C接种量)=0.002，P(D水分含量)=0.025，均小于0.05，影响显著。所以选择发酵时间、接种量和水分含量进行进一步响应面优化试验设计。

2.3 响应面试验设计及结果

根据单因素及Plackett-Burman(PB)试验结果，以发酵时间、接种量、水分含量3个因素为变量，以中性蛋白酶活力为响应值(Y)，进行响应面优化试验，试验设计及结果见表5。

表5 响应面试验设计及结果Table 5 The response surface test design and results

2.3.1 构建数学模型及模型检验

采用Design-Expert 8.0软件对试验数据进行分析，构建数学模型。通过对该模型进行方差分析，得到3个因素多元线性回归方程为：Y=366.74-26.38X1-14.97X2+20.22X3-3.36X1X2-14.47X1X3+19.96X2X3-117.84X12-79.80X22-131.76X32。对该模型进行显著性检验，回归模型方差分析见表6。

表6 回归模型方差分析Table 6 Analysis of variance of regression model

续 表

由表6可知，模型的P>F，P<0.0001，表明模型方程极显著，说明验证方法可行可靠；失拟项P=0.094>0.05，差异不显著，表明该回归方程的拟合度较好，能很好地反映检测过程中各种因素和中性蛋白酶(Y)之间的准确关系，能够利用回归方程得出最佳的发酵条件；模型的回归决定系数R2=0.9965，表明有99.65%的响应值变化是因为所选择的因素。二次项X12、X22、X32对Y有极显著影响，而一次项X1、X2、X3对Y的影响极显著(P<0.01)；交互项X1X3对Y的影响显著(P<0.05)，X2X3对Y的影响极显著(P<0.01)，而X1X2对Y的影响不显著。由F值可知，各因素对贝莱斯芽孢杆菌产蛋白酶活力的影响次序为X1>X3>X2。

由Design-Expert 8.0得出该菌株产中性蛋白酶活力的最佳发酵条件：发酵时间为28 h，接种量为3.4%，水分含量为18 mL，其相对酶活力达到369.66 U/g。

2.3.2 贝莱斯芽孢杆菌产中性蛋白酶活力发酵条件优化响应面图及等高线图

响应面分析及等高线见图6(图6中的A，B，C分别代表X1、X2、X3)。响应面及其等高线的形状可直观地反映各因素间的交互作用对中性蛋白酶活性的影响[19]。

图6 发酵时间、接种量和水分含量交互作用对中性蛋白酶活力影响的响应面及等高线图Fig.6 The response surface plots and contour lines of effects of interaction between fermentation time, inoculation amount and water content on neutral protease activity

由图6可知，AC、BC之间的交互作用显著，响应面等高线走势较陡，具有明显的最高点；AB的交互作用不显著，响应面等高线走势较平缓。

2.3.3 验证试验

为验证响应面试验所得结果的可靠性，对通过响应面试验得出的最佳发酵条件进行3次平行试验，测得中性蛋白酶活力为(370.03±1.56) U/g，与预测值(369.66±1.03) U/g相当接近，因此得到的模型能够较好预测实际中性蛋白酶活力，所以响应面法适用于贝莱斯芽孢杆菌产蛋白酶活力研究。

3 结论

在单因素的基础上，采用响应面法对贝莱斯芽孢杆菌产中性蛋白酶活力的发酵条件进行了优化。结果表明，产中性蛋白酶的最佳发酵条件：发酵时间为28 h，发酵温度为32 ℃，接种量为3.4%，水分含量为18 mL，豆粕粉含量为20%。在此条件下，进行了验证试验，结果测得中性蛋白酶活力均值为(370.03±1.56) U/g。以上研究为贝莱斯芽孢杆菌YB19后期产酶机理、酶学性质研究及在食醋酿造中的应用奠定了理论基础。