槐耳对人急性T淋巴细胞白血病CEM-C1细胞耐药性的逆转作用及机制

任丹薇，龙思利，覃祥，牛亚娜，钟芳芳，刘静，刘文君

西南医科大学附属医院儿科血液肿瘤病区/四川省出生缺陷临床医学研究中心，四川泸州 646000

急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia，ALL)是儿童最常见的恶性肿瘤，约占15岁以下儿童确诊总数的25%，且近年来ALL的发病率逐年升高[1-3]。文献报道，T细胞急性淋巴细胞白血病(T-ALL)的无事件生存率(event-free survival，EFS)明显低于B细胞急性淋巴细胞白血病(B-ALL)，且T-ALL诱导失败、复发、早期死亡的风险高于B-ALL[4]。欧美国家T-ALL患儿的5年EFS(5-EFS)为65.7%～83.8%，我国为40.2%～66.0%，预后较差[5-6]。 耐药及复发是ALL治疗失败的主要原因，也是阻碍ALL患儿长期存活的瓶颈[7]。其中，糖皮质激素(glucocorticoid，GC)耐药是导致儿童ALL治疗失败的主要原因之一[8]。儿童ALL初治病例中，约有20%的患儿对GC产生原发性耐药；而复发病例中，GC耐药率高达70%[9-10]。因此，寻找ALL耐药相关基因并制定克服ALL耐药的方案，已成为ALL临床研究的热点。

槐耳清膏是槐耳菌质的初提物，其主要活性成分是由6种单糖与18种氨基酸结合形成的多糖蛋白，具有调节免疫、抗肿瘤、抗病毒等作用[11-14]。另有研究发现，槐耳可逆转多种肿瘤的耐药性[15-17]， 但目前尚无槐耳逆转ALL耐药的相关报道。莫罗尼鼠白血病病毒前病毒整合位点(provirus integrating site moloney murine leukemia virus，Pim)家族基因包括Pim1、Pim2及Pim3，编码丝氨酸/苏氨酸激酶，可整合到细胞信号网络中，并调节多种细胞行为，如细胞增殖、存活及迁移等，与肿瘤的发生发展密切相关[18-19]。Pim3是新近发现且研究较少的一个Pim亚型，与胰腺癌等多种肿瘤耐药相关，可能参与了肿瘤耐药性的形成过程[20-21]。本研究以GC耐药细胞株CEM-C1及GC敏感细胞株CEM-C7为研究对象，探讨槐耳能否逆转ALL细胞对GC的耐药性及其可能机制，旨在探索改善ALL对GC耐药的新方法，为优化儿童ALL治疗方案及改善患儿预后提供新思路。

1 材料与方法

1.1 材料 人ALL细胞株CEM-C1、CEM-C7由四川大学华西第二医院马志贵教授馈赠。槐耳购自中国江苏启东盖天力药业有限公司；地塞米松(dexamethasone，DEX)购自国药集团容生制药有限公司；RPMI 1640培养液购自美国Hyclone公司；胎牛血清购自中国杭州四季青公司；二甲基亚砜(DMSO)购自美国Sigma公司；青霉素及链霉素双抗、总RNA提取试剂盒、CCK-8及辣根过氧化物酶标记山羊抗兔二抗购自上海碧云天公司；反转录试剂盒及实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)试剂盒购自日本ToYoBo公司；GAPDH、Pim3引物购自上海生工生物工程股份有限公司；FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit Ⅰ细胞凋亡检测试剂盒购自美国BD公司；细胞周期检测试剂盒购自南京凯基生物科技有限公司；兔抗人GAPDH一抗购自美国Proteintech公司；兔抗人多药耐药基因1(MDR1)、Pim3单克隆抗体一抗购自英国CST公司。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养及分组 将CEM-C1、CEM-C7细胞悬浮于含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素及0.1 mg/ml链霉素双抗的完全培养基中，并接种于培养瓶，置于37 ℃、含5%CO2、饱和湿度的培养箱中连续培养，每2 d更换1次培养液并传代，取对数生长期的细胞进行后续实验。CEM-C1、CEM-C7细胞经不同浓度(0、100、200、400、600、800 μg/ml) 槐耳处理24、48、72 h后，根据CCK-8实验确定48 h为干预时间，200、600 μg/ml槐耳为后续实验的干预浓度，100 μg/ml槐耳作为联合用药浓度与不同浓度(12.5、25、50、100、200 μg/ml)DEX联合作用于CEM-C1细胞。

1.2.2 CCK-8检测细胞的增殖抑制率 收集对数生长期的CEM-C1、CEM-C7细胞，调整细胞密度为2×105个/ml，转移90 μl细胞悬液至96孔板中，每孔加入10 μl预设浓度的各组药物，使槐耳终浓度为50、100、200、400、600、800 μg/ml，DEX终浓度为12.5、25、50、100、200 μg/ml，以及100 μg/ml槐耳联合不同浓度(12.5、25、50、100、200 μg/ml)DEX，同时设置对照组(仅含培养基及细胞)及空白组(仅含培养基)，每组设4个复孔，放入CO2培养箱内培养24、48、72 h后，每孔再加10 μl CCK-8溶液，放入CO2培养箱内孵育4 h，用酶标仪在450 nm处测定各孔的光密度(OD)值。实验独立重复4次。细胞增殖抑制率(%)=1－[(OD实验组－OD药物对照)/(OD对照组－ OD空白组)]×100%。采用GraphPad Prism7软件计算半数抑制浓度(IC50)。耐药逆转倍数=耐药株的IC50/加药处理耐药株的IC50。两药相互作用指数(coefficient of drug interaction，CDI)=AB/(A×B)，其中AB为OD联合组/OD对照组，A、B分别为两种药物的OD单药组/OD对照组。若CDI＜1，两药为协同作用，值越小协同作用越强；CDI=1，两药为相加作用；CDI＞1，两药为拮抗作用，值越大拮抗作用越强[22]。

1.2.3 流式细胞术检测细胞凋亡情况 取对数生长期的CEM-C1、CEM-C7细胞，经不同浓度(0、200、600 μg/ml)槐耳处理48 h后，用冷PBS洗涤2次，加入1×结合缓冲液重悬细胞，调整细胞密度为3×106个/ml，取100 μl细胞悬液于5 ml Falcon试管中，加入5 μl FITC Annexin V及5 μl PI，室温避光染色15 min，然后加入300 μl结合缓冲液混匀，在1 h内用流式细胞仪检测细胞凋亡率。实验独立重复3次。

1.2.4 流式细胞术检测细胞周期 取对数生长期的CEM-C1、CEM-C7细胞，经不同浓度(0、200、600 μg/ml)槐耳处理48 h后，用冷PBS洗2次，调整细胞密度为1×106个/ml，取1 ml单细胞悬液，弃上清，用70%的冷乙醇500 μl悬浮细胞，4 ℃过夜固定；PBS洗涤后加入500 μl预先配制的PI/RNase A工作液混匀，室温、避光放置30～60 min，流式细胞仪检测488 nm波长处的红色荧光。实验独立重复3次。

1.2.5 Western blotting检测细胞MDR1、Pim3蛋白的表达水平 收集细胞，设置CEM-C1、CEM-C7细胞组及C E M-C 1 细胞经不同浓度(0、2 0 0、600 μg/ml)槐耳处理组，按照全蛋白提取试剂盒说明书提取细胞全蛋白。BCA法测蛋白浓度，根据蛋白浓度取等量蛋白，加5×SDS上样缓冲液煮沸5 min，进行SDS-PAGE电泳后将蛋白转移到PVDF膜上，用含5%脱脂奶粉的PBST封闭1 h，经PBST充分洗涤10 min×3次，MDR1、Pim3单克隆抗体均按1:1000稀释。4 ℃孵育过夜，充分洗涤后加山羊抗兔二抗，按1:2000稀释，室温孵育1 h，化学发光显影。采用Image J软件分析图像，以MDR1、Pim3蛋白条带灰度值与GAPDH蛋白条带灰度值的比值表示目的蛋白的相对表达水平。实验独立重复3次。

1.2.6 qRT-PCR检测细胞中Pim3 mRNA的表达水平 收集细胞，设置CEM-C1、CEM-C7细胞组及CEM-C1细胞经不同浓度(0、200、600 μg/ml) 槐耳处理组，用总RNA提取试剂盒提取总RNA，反转录为cDNA，荧光定量PCR法扩增目的基因及内参基因GAPDH。Pim3引物：正向5'-ACCGACTT CGACGGCAC-3'，反向5'-TATCGTAGAGAAGCACG CCC-3'；GAPDH引物：正向5'-ATGCTGGCGCT GAGTACGTC-3'，反向5'-GGTCATGAGTCCTTCCA CGATA-3'。qRT-PCR反应条件：95 ℃预变性30 s；95 ℃变性5 s，60 ℃退火10 s，72 ℃延伸30 s，共40个循环。采用公式2-ΔΔCt计算目的基因mRNA的相对表达水平。均设3个复孔，实验独立重复3次。

1.3 统计学处理 采用SPSS 20.0软件进行统计分析。计量资料以±s表示，两样本比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 槐耳对ALL细胞增殖的影响 CCK-8检测结果显示，用槐耳对CEM-C1及CEM-C7细胞处理24 h及72 h，100、200、400、600、800 μg/ml槐耳组的增殖抑制率明显高于50 μg/ml槐耳组；槐耳处理48 h，细胞增殖抑制率呈剂量依赖方式增加，差异有统计学意义(P＜0.05，图1)。根据结果选用200、600 μg/ml槐耳作为本实验的干预浓度，100 μg/ml 槐耳作为联合用药浓度。槐耳处理CE M-C 1 及CEM-C7细胞24、48、72 h后，CEM-C1细胞的IC50分别为2272.0、313.4、1275.0 μg/ml，CEM-C7细胞的IC50分别为1406.0、757.5、1653.0 μg/ml，表明槐耳处理48 h对CEM-C1及CEM-C7细胞增殖的抑制作用最强，因此后续实验选择48 h作为干预时间。

2.2 槐耳对CEM-C1细胞耐药性的逆转作用 CCK-8检测结果显示，不同浓度(12.5、25、50、100、200 μg/ml)DEX单独作用于两种细胞48 h后，CEM-C1细胞的IC50为98.89 μg/ml，CEM-C7细胞的IC50为0.16 μg/ml，依据公式计算CEM-C1细胞的耐药倍数是CEM-C7细胞的618.06倍，符合两种细胞的特性。槐耳(100 μg/ml)+DEX处理CEM-C1细胞后的IC50为73.75 μg/ml，耐药逆转倍数为1.34倍，差异有统计学意义(P＜0.05)；而联合用药对CEM-C7细胞无明显影响。与单用DEX各组比较，100 μg/ml 槐耳联合低浓度(12.5、25、50 μg/ml)DEX提高了CEM-C1细胞的增殖抑制率，差异有统计学意义(P＜0.05，表1)；各浓度DEX联用槐耳的CDI均＜1，表明两药具有协同作用。

图1 槐耳对CEM-C1及CEM-C7细胞增殖的影响(n=4)Fig.1 Effect of Huaier on the proliferation of CEM-C1 and CEM-C7 cells (n=4)

2.3 槐耳对CEM-C1、CEM-C7细胞凋亡的影响 流式细胞术检测结果显示，随着槐耳浓度的增加，CEM-C1及CEM-C7细胞的凋亡率逐渐增高，与对照组(0 μg/ml槐耳)比较差异有统计学意义(P＜0.05，表2)。

表1 DEX+槐耳对CEM-C1细胞增殖抑制率的影响(±s，n=4)Tab.1 Effect of DEX+Huaier on the inhibition ratio to CEM-C1 cells proliferation (±s, n=4)

表1 DEX+槐耳对CEM-C1细胞增殖抑制率的影响(±s，n=4)Tab.1 Effect of DEX+Huaier on the inhibition ratio to CEM-C1 cells proliferation (±s, n=4)

CDI. 两药相互作用指数

DEX浓度(μg/ml) 细胞增殖抑制率(%) CDI t/Z P DEX组 100 μg/ml槐耳+DEX组12.5 10.020±0.783 20.820±2.224 0.847±0.108 -9.163 0.001 25 13.850±1.302 25.140±3.352 0.817±0.121 -6.282 0.004 50 23.160±5.649 32.240±2.353 0.816±0.120 -2.968 0.025 100 48.410±6.810 58.280±4.428 0.768±0.240 -2.429 0.051 200 74.000±2.593 77.190±0.553 0.794±0.190 -2.406 0.088

表2 不同浓度槐耳对CEM-C1及CEM-C7细胞凋亡率的影响(%，±s，n=3)Tab.2 Effect of different concentrations of Huaier on the apoptosis of CEM-C1 and CEM-C7 cells (%,±s, n=3)

表2 不同浓度槐耳对CEM-C1及CEM-C7细胞凋亡率的影响(%，±s，n=3)Tab.2 Effect of different concentrations of Huaier on the apoptosis of CEM-C1 and CEM-C7 cells (%,±s, n=3)

与0 μg/ml槐耳组比较，(1)P＜0.05；与200 μg/ml槐耳组比较，(2)P＜0.05。

槐耳浓度 CEM-C1细胞凋亡率 CEM-C7细胞凋亡率0 μg/ml 9.937±0.966 7.810±0.850 200 μg/ml 27.780±0.528(1) 26.643±1.310(1)600 μg/ml 35.577±1.258(1)(2) 34.820±0.697(1)(2)F 556.401 590.162 P＜0.001 ＜0.001

2.4 不同浓度槐耳对CEM-C1细胞周期的影响 流式细胞术检测结果显示，200、600 μg/ml槐耳处理CEM-C1、CEM-C7细胞48 h后，S期细胞比例比对照组增高，G0/G1期细胞比例比对照组降低，差异有统计学意义(P＜0.05)，各组细胞的G2/M期比例差异无统计学意义(P＞0.05，表3)。

2.5 CEM-C1、CEM-C7细胞中及槐耳处理后CEM-C1细胞中MDR1、Pim3蛋白表达水平比较 Western blotting检测结果显示，CEM-C1细胞中MDR1蛋白表达水平(2.41±0.32)明显高于CEM-C7细胞(1.34±0.43)，差异有统计学意义(t=3.45，P＜0.05，图2A)。CEM-C1细胞经200、600 μg/ml槐耳处理后，MDR1蛋白表达水平均低于0 μg/ml槐耳组(1.62±0.03、1.34±0.16 vs. 1.92±0.10)，差异有统计学意义(P＜0.05，图2B)。CEM-C7细胞中Pim3蛋白表达水平(0.13±0.05)明显低于低于CEM-C1细胞(0.39±0.10)，差异有统计学意义(t=3.94，P＜0.05，图2C)。CEM-C1细胞经200、600 μg/ml槐耳处理后，Pim3蛋白表达水平均低于0 μg/ml槐耳组(1.05±0.14、0.75±0.13 vs. 1.48±0.33)，差异有统计学意义(P＜0.05，图2D)。

2.6 CEM-C1、CEM-C7细胞中及槐耳处理后CEM-C1细胞中Pim3 mRNA表达水平的比较 qRTPCR结果显示，CEM-C7细胞的Pim3 mRNA相对表达水平低于CEM-C1细胞(0.37±0.02 vs. 1.00)，差异有统计学意义(t=58.88，P＜0.05，图3A)；与0 μg/ml槐耳组(1.00)比较，200、600 μg/ml槐耳组CEM-C1细胞中Pim3 mRNA的表达水平均明显降低(分别为0.79±0.12、0.59±0.10)，且600 μg/ml槐耳组明显低于200 μg/ml槐耳组，差异有统计学意义(P＜0.05，图3B)。

表3 不同浓度槐耳对CEM-C1及CEM-C7细胞周期的影响(%，±s，n=3)Tab.3 Effects of different concentrations of Huaier on the cell cycle of CEM-C1 and CEM-C7 cells (%,±s, n=3)

表3 不同浓度槐耳对CEM-C1及CEM-C7细胞周期的影响(%，±s，n=3)Tab.3 Effects of different concentrations of Huaier on the cell cycle of CEM-C1 and CEM-C7 cells (%,±s, n=3)

与0 μg/ml槐耳组比较，(1)P＜0.05。

槐耳浓度(μg/ml) CEM-C1细胞周期 CEM-C7细胞周期S G2/M G0/G1 S G2/M G0/G1 0 34.807±1.305 9.967±0.112 55.227±1.416 37.823 ±6.362 8.483±1.292 53.693±7.547 200 39.363±0.785(1) 12.790±1.523 47.847±1.250(1) 61.010 ±1.715(1) 6.010±0.306 32.977±1.486(1)600 44.253±2.975(1) 7.663±1.438 48.083±1.857(1) 41.617 ±1.364(1) 10.680 ±0.528 47.553±0.970(1)F 17.985 13.481 22.567 30.752 5.725 16.955 P 0.028 0.059 0.001 ＜0.001 0.068 0.003

图2 各组细胞中MDR1、Pim3蛋白表达水平比较Fig.2 Comparison of the protein expression levels of MDR1, Pim3 in each group

图3 各组细胞中Pim3 mRNA表达水平比较 (n=3)Fig.3 Comparison of the expression levels of Pim3 mRNA in each group (n=3)

3 讨 论

目前对肿瘤的治疗多采用放疗、化疗、手术等综合治疗，但随着对中草药认识的深入，中草药在肿瘤治疗中也发挥了独特的作用，与化疗药物联合应用可增效解毒、延长生命、改善患者生存状态，已成为近年来研究的热点。槐耳又名槐栓菌，为寄生于槐树上的木耳，是一种非常重要的药用真菌，始载于《唐本草》[23]。槐耳清膏作为槐耳菌质的初提物，通过加入相应的辅料、烘干可制作成槐耳颗粒。槐耳因具有抗肿瘤作用，现已广泛应用于原发性肝癌、胃癌、乳腺癌等肿瘤的辅助治疗[24-26]。单中心研究发现，槐耳颗粒治疗成人慢性粒细胞白血病慢性期患者的总有效率可达80%[27]。本研究发现，槐耳可剂量依赖性地抑制CEM-C1、CEM-C7细胞的增殖并促进其凋亡，表明槐耳对ALL细胞具有抗肿瘤效应。有研究表明，槐耳可逆转肝癌、胃癌等肿瘤细胞的耐药性[28-30]。Qu等[31]的研究发现，槐耳可增强伊马替尼在Ikaros基因亚型6(ikaros isoform 6，Ik6)阳性及Ph染色体阳性的急性淋巴细胞白血病(Ik6+Ph+ALL)中的敏感性。本研究发现，与单用DEX比较，100 μg/ml槐耳联合DEX可进一步抑制CEM-C1细胞的增殖，耐药逆转倍数为1.34倍。与对照组(0 μg/ml槐耳)比较，200、600 μg/ml 槐耳组的G0/G1期细胞比例降低，S期细胞比例增高，提示槐耳可在一定程度上阻滞细胞的G0/G1期，减少细胞分裂增殖，从而促进细胞凋亡，部分逆转CEM-C1细胞对GC的耐药性。本研究还发现，与GC敏感株CEM-C7细胞比较，GC耐药株CEM-C1细胞中多药耐药基因MDR1呈高表达，经槐耳处理后，CEM-C1细胞中MDR1的表达呈剂量依赖性的下降，与童琳等[12]在肝癌中的研究结果相似。以上结果表明，槐耳可在一定程度上逆转ALL细胞的耐药性，并增强CEM-C1细胞对DEX的敏感性。

Pim3基因最初是通过病毒插入筛选发现的，该基因可促进淋巴瘤的发展[32-33]。作为Pim家族中的一员，Pim3位于22号染色体(22q13)，是发现最晚、研究最少的一个亚型[34-35]。Pim3参与介导多种肿瘤的发生发展，在胃癌、肝癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、急性白血病及淋巴瘤等恶性肿瘤中均呈高表达[36-41]。还有研究发现抑制Pim3能抑制前列腺癌、肝癌、胃癌等肿瘤的进展[36-37,42]。作为新近发现且研究较少的一个亚型，Pim3还被发现与多种肿瘤耐药相关：Guo等[37]发现，沉默Pim3能逆转胃癌耐药；Xu等[20]发现，沉默Pim3可抑制胰腺癌细胞的增殖并增加其对吉西他滨化疗的敏感性。本研究结果显示，耐药细胞CEM-C1中Pim3蛋白及mRNA表达水平均高于敏感细胞CEM-C7，提示Pim3可能参与介导了ALL的耐药；采用不同浓度槐耳处理CEM-C1细胞后，其Pim3蛋白及mRNA表达水平均明显降低，表明Pim3可能是槐耳逆转ALL耐药性的靶点之一。因此，以Pim3为目的基因的基因抑制可能为逆转ALL耐药提供新的治疗策略及治疗靶点。

综上所述，槐耳作为一种中成药制剂，可抑制ALL细胞的增殖并促进其凋亡，调节细胞周期，增强白血病细胞对GC的敏感性，其作用机制可能与下调Pim3有关。本研究结果为槐耳辅助治疗ALL提供了新的理论依据，槐耳抑制Pim3基因的表达可能是一种潜在的治疗ALL耐药的有效方法，但其具体机制尚需进一步深入研究。